Dokument: Rapid development of small-molecule producing microoganisms based on metabolite sensors

Titel:	Rapid development of small-molecule producing microoganisms based on metabolite sensors
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=26245
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20130711-110042-6
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Binder, Stephan [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 21,64 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 09.07.2013 / geändert 09.07.2013
Beitragende:	Prof. Dr. Bott, Michael [Gutachter] Prof. Dr. Jaeger, Karl-Erich [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Durch Mikroorganismen hergestellte Metabolite, wie z.B. Aminosäuren, Vitamine, organische Säuren oder auch Antibiotika, stellen wichtige industrielle Produkte dar. Allerdings ist die Entwicklung der mikrobiellen Produzenten dadurch beschränkt, dass in der Regel aufwendig konstruierte Plasmide benötigt werden und in vielen Fällen noch keine Methoden zum Hochdurchsatzscreening von Produktionsstämmen auf Ebene von Einzelzellen existieren. In der vorliegenden Dissertation werden diese Probleme angegangen und die resultierenden Entwicklungen auf Corynebacterium glutamicum angewandt. Zunächst wurde der Metabolitsensor pSenLys konstruiert, der den Transkriptionsregulator LysG und die Promotorsequenz des Zielgens lysE nutzt. Durch Fusion von eyfp mit dieser Promotorsequenz zeigen Zellen als Antwort auf graduell erhöhte cytosolische L-Lysinkonzentration – dies ist bei Stämmen mit erhöhter Produktivität der Fall ist – ein graduell erhöhtes Fluoreszenzsignal. Dies ermöglicht das Hochdurchsatzscreening unterschiedlich produzierender Einzellzellen mittels fluorescent activated cell sorting (FACS). Die Isolation von Produzenten aus einer Population mit Nicht-Produzenten, die in 10.000 fachem Überschuss vorlagen, ergab eine Sortiergenauigkeit von mehr als 91 %. Weitere Metabolitsensoren für die Detektion von L-Serin und O-Acetyl- L-Serin in C. glutamicum und L-Arginin in E. coli wurden entwickelt. Hiermit wurde die Nutzbarkeit von Metabolitsensoren für die Einzellzell-Analytik demonstriert und eröffnet eine Vielzahl neuer Möglichkeiten für die mikrobielle Populationsanalyse. Die etablierte Screeningroutine wurde erfolgreich eingesetzt, um 270 fluoreszierende Zellen aus einer mutagenisierten C. glutamicum Population zu isolieren. 185 Klone akkumulierten L-Lysin in Konzentrationen von 0,2 bis 37 mM. Die Sequenzierung von sechs Genen aus 40 der 185 Mutanten führte zur Identifikation von 24 Stämmen, welche bekannte, aber auch neue Mutationen in diesen Genen aufwiesen. In 16 Stämmen war keines dieser Gene mutiert. Von insgesamt zehn dieser Stämme wurden die Genome sequenziert und pro Genom zwischen 36 und 268 SNPs ermittelt. In einem dieser Stämme war die UDP-MurNac-Tripeptid Synthetase an Position 81 mutiert, resultierend in MurE-G81E. Einführen dieser bislang unbekannten Mutation in das Genom des Wildtyps, aber auch in definierte Lysinproduktionsstämme, führte in allen Fällen zu einer deutlichen Produktivitätssteigerung. Es sind zwar verschiedene Gene bekannt, die zu erhöhter L-Lysinbildung führen, allerdings ist die hier beschriebene murE-Mutation, neben Mutationen in lysC und hom, bislang die erste neue Mutation, die als alleinige Mutation im Wildtyphintergrund zu erhöhter L-Lysinbildung führt. Zur schnellen Manipulation des C. glutamicum Genoms wurde anschließend recombination-mediated genetic engineering (recombineering) entwickelt. Recombineering ist eine hoch effiziente Technologie zur schnellen in vivo Manipulation von Genomen. Diese unterliegt im Gegensatz zu herkömmlichen Methoden nicht der Nutzung aufwendiger Vektorkonstruktionen, sondern benötigt lediglich den Einsatz von Oligonukleotiden (Oligos) oder auch PCR-Fragmenten. Ein Teststamm wurde konstruiert, bei dem ein defektes KanR Gen im Genom integriert wurde. In diesem Stamm wurden fünf unterschiedliche Rekombinasen exprimiert und mit Hilfe von 100-mer Oligonukleotiden, welche die defekte Kan-Sequenz bei erfolgreicher Integration reparieren, auf Funktionalität hin überprüft. RecT aus dem E. coli Prophagen Rac wurde als außerordentlich effiziente Rekombinase identifiziert. Insgesamt konnten in einem Ansatz 2x106 Kan-resistente Zellen erzeugt werden. Dies bedeutet, dass die erreichte Rekombinationsfrequenz in C. glutamicum höher ist, als die mit Plasmiden erreichten Transformationseffizienzen. Darüber hinaus ermöglichte recombineering in Kombination mit dem Metabolitsensor pSenLys und der FACS Routine die Generierung und direkte Isolation produzierender Zellen, welche die lysC-T311I Mutation tragen. Von dieser Mutation ist bekannt, dass sie zur L-Lysinüberproduktion führt und sie wurde mittels Oligos in das Genom eingefügt. In einem weiteren Experiment wurde das Codon 81 von murE in vivo durch site directed saturation mutagenesis modifiziert. Hierfür wurden 20 unterschiedliche Oligos genutzt, um an diesem Lokus, in einem einzigen Ansatz, genetische Diversität zu erzeugen, welche zur L-Lysinproduktion führt. Insgesamt konnten 21 rekombinante Stämme mit erhöhter L-Lysinbildung isoliert werden, bei denen G in MurE an Position 81 durch C, F, L, D, S, V, W oder Y ausgetauscht wurde. Diese Experimente demonstrieren den erfolgreichen Einsatz und das enorme Potential von recombineering in C. glutamicum in Kombination mit sensor-basierter Produzentenisolierung. Die entwickelte Methode könnte zukünftig eine universelle und effiziente Strategie darstellen, um mikrobielle Metabolitproduzenten in hoher Geschwindigkeit zur entwickeln. Small-molecules made by microorganisms, such as amino acids, vitamins, organic acids or antibiotics are industrially important substances. However, there are two major limitations in microbial strain development. First, laborious plasmid constructions are usually involved in strain development. Second, no general high-throughput screening methodology exists to identify a producer at the single-cell level. In the present doctoral thesis these problems are addressed and applied to Corynebacterium glutamicum. The metabolite sensor pSenLys was constructed. It uses the transcriptional regulator LysG of C. glutamicum, as well as the promotor of its target gene lysE. Fusion with eyfp resulted in a graded fluorescence output in response to the cytosolic L-lysine concentration, which increases in strains with higher productivity. Turning the inconspicuous metabolite L-lysine into a conspicuous one enabled the high-throughput screening of producing cells via fluorescent activated cell sorting (FACS). A screening accuracy exceeding 91 % was determined by isolation of fluorescent cells out of a population consisting of non-producing cells in a 10.000 fold excess over producing cells. Furthermore, metabolite sensors were developed for the detection of L-serine and O-acetyl- L-serine in C. glutamicum and L-arginine in E. coli. Single-cell analysis using metabolite sensors and FACS of L-lysine producing strains is demonstrated, opening up a number of different possibilities for microbial population analysis. The established screening routine was used to isolate 270 fluorescent cells from a randomly mutagenized population of C. glutamicum. 185 clones accumulated L-lysine in the range of 0.2 to 37 mM. Targeted sequencing of six genes from 40 of the 185 mutants resulted in 24 strains carrying known mutations, or mutations in known genes, whereas in 16 mutants no known gene was mutated. Sequencing the genomes of 10 mutants revealed that they carry between 36 and 268 SNPs. In one strain the UDP-MurNac-tripeptide synthetase was mutated resulting in MurE-G81E. Introduction of this, so far unknown, mutation into the genome of the wild type, and also into defined L-lysine producers, caused an increased L-lysine production in all strains. Consequently, murE is now the third gene in addition to lysC and hom which, when mutated alone, causes an increased L-lysine production. Thus, the principle of the use of a metabolite sensor for high-throughput isolation of new producers and identification of new targets has been demonstrated successfully. Driven by the wish for rapid manipulation of the C. glutamicum genome, recombination-mediated genetic engineering was developed. Recombineering is a highly efficient technology for rapid in vivo genome engineering and does not rely on laborious vector constructions, but the use of ssDNA oligonucleotides (oligos) or PCR-generated dsDNA fragments. A tester strain was constructed containing a defective KanR gene integrated in its genome. Five different recombinases were expressed and tested for functionality in C. glutamicum using a 100-mer oligo recovering the KanR gene. RecT of the E. coli prophage Rac was identified as a very efficient recombinase yielding 2x106 kanamycin resistant cells. This means that the frequency of recombination in C. glutamicum under optimized conditions is higher than standard transformation frequencies obtained with a plasmid. Combination of both, recombineering and metabolite sensing using pSenLys, enabled the simple and fast introduction of the lysC-T311I mutation and screening for producers carrying this mutation. This mutation is known to cause L-lysine overproduction and it was efficiently introduced into the genome using an appropriate oligo. In another experiment codon 81 of murE was targeted for in vivo site directed saturation mutagenesis. In this case 20 different oligos were used at once to introduce genetic diversity at this locus causing L-lysine overproduction. 21 recombinants were isolated, where G in MurE position 81 was replaced by C, F, L, D, S, V, W, or Y, leading to increased productivities. These experiments demonstrate the successful use and enormous potential of recombineering in C. glutamicum, when used together with metabolite sensor-based producer isolation. The procedure developed might represent a general and highly efficient strategy for rapid development of microbial metabolite producers.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät
Dokument erstellt am:	11.07.2013
Dateien geändert am:	11.07.2013
Promotionsantrag am:	20.12.2012
Datum der Promotion:	14.02.2013