Dokument: Eine MHz-Lichtquelle für die Femtosekunden-Stimulierte Raman-Mikroskopie
| Titel: | Eine MHz-Lichtquelle für die Femtosekunden-Stimulierte Raman-Mikroskopie | |||||||
| Weiterer Titel: | A Mhz lightsource for femtosecond stimulated Raman microscopy | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=26194 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20130716-100012-8 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Deutsch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Marx, Philipp Benjamin [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Prof. Dr. Gilch, Peter [Gutachter] Prof. Dr. Weinkauf, Rainer [Gutachter] | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik » 530 Physik | |||||||
| Beschreibungen: | Die Schwingungsspektroskopie ist eine wichtige Methode zur Analyse von Molekülen, da anhand des Schwingungsspektrums eines Moleküls wichtige Aussagen über dessen Struktur getroffen werden können. Die IR-Absorptionsspektroskopie und die Ramanspektroskopie sind die zwei bedeutsamsten Techniken, um Schwingungsspektren aufzunehmen. Beide Techniken eignen sich zur Gewinnung von Schwingungsspektren mikroskopischer Proben. Damit können diese nicht nur morphologisch charakterisiert werden wie in der konventionellen Lichtmikroskopie, sondern auch anhand ihrer molekularen Zusammensetzung. Die Ramanmikroskopie besitzt eine höhere räumliche Auflösung als die IR-Mikroskopie, aber eine geringere Signalstärke als diese. Deswegen wurden optisch nichtlineare Techniken wie die kohärente anti-Stokes Ramanstreuung (CARS) und die stimulierte Ramanstreuung (SRS) zur Signalverstärkung in der Ramanmikroskopie angewandt. Die Femtosekunden-stimulierte Ramanspektroskopie (FSRS) ermöglicht die spektral breitbandige Aufnahme von (stimulierten) Ramanspektren. Man benötigt für die FSRS zwei Lichtimpulse: Einen spektral breitbandigen Impuls als "Ramanprobeimpuls" und einen spektral schmalbandigen und intensiven Impuls als "Ramanpumpimpuls". Diese Technik wurde 2007 von Ploetz et al. erstmals in der Mikroskopie als Kontrastmechanismus eingesetzt und in Anlehung an die FSRS Femtosekunden-stimulierte Raman-Mikroskopie (FSRM) genannt. Die verwendeten Lichtimpulse wurden von einem Ti:Sa-Laser/Verstärkersystem mit einer Wiederholrate von 1 kHz abgezweigt und entsprechend den jeweiligen Erfordernissen für Ramanpump bzw. -probeimpuls angepasst. Der verwendete Ramanpumpimpuls aus diesem Lasersystem besaß eine Energie im Bereich von einigen 100 nJ. Wenn diese Energie mit Hilfe eines Mikroskopobjektives fokusiert wird, ergibt sich im Fokus eine Spitzenleistung, die unverträglich mit biologischen Proben ist.
Deswegen wurde eine neue Lichtquelle konzipiert, die auf einem Ti:Sa-Oszillator mit einer Wiederholrate von 75 MHz beruht und eine entsprechend niedrigere Impulsenergie aufweist. Die Kernidee dieses Konzeptes ist, dass der Ramanprobeimpuls ohne weitere Konversion direkt im Laseroszillator erzeugt wird und dann der Ramanpumpimpuls aus dem Flügel des Oszillatorspektrums verstärkt wird. Dieses Konzept wurde im Zuge dieser Arbeit realisiert: Es wurde ein Ti:Sa-Oszillator mit einem sehr breitem Spektrum beschafft und eine Faserverstärker aufgebaut, um den Ramanpumpimpuls zu erzeugen. Der Faserverstärker benutzt Yb3+-dotierte Fasern als aktives Medium. Die erzeugten Impulse wurden zeitlich und spektral charakterisiert. Die spektrale Breite des Ramanprobeimpulses betrug ca. 1875 cm-1. Der Ramanpumpimpuls besaß eine Energie von ca. 0.5 nJ, er war 1.2 ps lang und das Spektrum war 18 cm-1 breit. Mit Hilfe dieser Lichtimpulse gelang es stimulierte Ramanspektren von Reinsubstanzen aufzunehmen. Der abgebildete Spektralbereich des Schwingungsspektrums reichte von 900-4000 cm-1. Die spektrale Auflösung betrug ca. 20 cm-1. Dabei wurde eine neue Messmethodik, das sogenannte „Phasestepping“, auf die FSRM angewandt. Diese ermöglichte die Verwendung eines Detektors mit „Rolling-Shutter“ ohne systematischen Fehler. Die Ramanbandenhöhen des stimulierten Ramanspektrums von Benzonitril wurden mit den Bandenhöhen des spontanen Ramanspektrums von Benzonitril verglichen und eine systematische Abweichung festgestellt. Um diese Lichtquelle für die FSRM nutzbar zu machen, wurde ein rasterndes Mikroskop aufgebaut. Zunächst wurden mit diesem Mikroskopiestandards aus unterschiedlichen Polymeren abgebildet. Mit Hilfe einer Hauptwertanalyse gelang es die verschiedenen Polymere zu unterscheiden. Daraufhin wurde auch eine menschliche Epithelzelle abgebildet. Die Ramanspektren dieser Abbildung wurden anhand des Ramansignals einer einzelnen Ramanbande ausgewertet und dargestellt. Das Rauschen bei der Messung von Ramanspektren wurde ausführlich analysiert. Dieses setzte sich aus dem Schrotrauschen durch die Photonen des Ramanprobeimpulses und dem Laseramplitudenrauschen zusammen. Das Signal-zu-Rauschverhältnis eines mit dem Aufbau aufgenommen Ramanspektrums genügt im derzeitigen Zustand nicht, um anhand des "Fingerprint"-Bereichs des Spektrums Zellkompartimente zu differenzieren. Eine höhere Detektionsrate könnte sowohl den Beitrag des Schrotrauschens als auch den des Amplitudenrauschens zum Gesamtrauschen senken. Ein optimierter Pumpimpuls, ein Detektor mit höherer Ausleserate und bessere Datenaufbereitung werden den Weg zur Bildgebung an biologischen Proben mit der FSRM ebnen.Vibrational Spectroscopy is an important tool for the characterization of molecules, because the vibrational spectrum of a molecule contains detailed information on its structure. IR absorption spectroscopy and Raman spectroscopy are the most prominent techniques in use to record the vibrational spectrum of a molecule. Both techniques can be applied to microscopic samples. Raman and IR microscopy can characterize a sample not only morphologically as conventional light microscopy can, but also based on their molecular composition. The spatial resolution of Raman microscopy is better, the signal much weaker compared to IR microscopy. Nonlinear optical techniques like coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) and stimulated Raman scattering (SRS) have been applied in Raman microscopy to improve the Raman signal. Femtosecond stimulated Raman scattering (FSRS) enables the measurement of broadband Raman spectra. Two light pulses are employed for FSRS: a spectrally broadband pulse known as "'probe"' pulse and an intense, spectrally narrow pulse known as "'pump"' pulse. FSRS was introduced into the field of microscopy by Ploetz et al. in 2007 and referred to as femtosecond stimulated Raman microscopy (FSRM). In this first implementation the light pulses have been branched of a Ti:Sapph Laser/Amplifier system with a 1 kHz repetition rate. The energy of the pump pulse amounted to some 100 nJ. When the pump pulses are focused by a microscope objective, the peak power of these pulses is not compatible to biological samples. A new lightsource relying on a Ti:Sapph oscillator with a MHz repetition rate has therefore been devised. With this light source the pump pulses are order of magnitudes lower in energy. The probe pulse is generated directly from the laser oscillator and the pump pulse is generated by amplifying the spectral wing of the oscillator spectrum. This concept has been realized in this thesis: A commercial, broadband oscillator has been puchased, and a fiber amplifier relying on Yb3+-doped fibers has been assembled, to generate the pump pulsse. The pulses have been characterised spectrally and temporally. The spectral width of the probe pulse amounted to 1875 cm-1. The energy of the pump pulse amounted to 0.5 nJ, the duration to 1.2 ps and the spectral width to 18 cm-1. Stimulated Raman spectra were recorded using these light pulses. A spectral coverage of 900-4000 cm-1 was achieved, and the spectral resolution amounted to ca. 20 cm-1. The "'phase stepping"' method was applied for the recording of the spectra. This method enabled measurements with a rolling shutter detector without systematic errors. The Raman band integrals of the stimulated Raman spectrum of Benzonitril was compared with the band integrals of spontaneous Raman spectrum of this substance, and a systematic difference between both of these was observed. A raster scanning microscope was designed and built specifically for the lightsource. The setup was emploid for the mapping of different polymer microscopy standards. A subsequent principal component analysis (PCA) of the recorded data set could differentiate between the different components of the sample. This first demonstration of the imaging capability of the setup was followed by the imaging of an human epithelial cell. The hyperspectral data set of this measurement was univariately analysed based on a single Raman band integral. The measured spectra have been analysed to determine the noise contributions. The main noise sources are the shot noise of the photons of the probe pulse and the laser amplitude noise. At present the measurement of the cell could not be interpreted based on the the fingerprint region of the raman spectrum because of the low signal-to-noise ratio. At a higher detection rate, the shot noise as well as the laser amplitude noise should decrease. An optimized pump pulse, a detector with a higher detection rate and improved data processing will pave the way for biological imaging with FSRM. | |||||||
| Lizenz: |  Urheberrechtsschutz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Chemie » Physikalische Chemie und Elektrochemie | |||||||
| Dokument erstellt am: | 16.07.2013 | |||||||
| Dateien geändert am: | 16.07.2013 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 14.05.2013 | |||||||
| Datum der Promotion: | 26.06.2013 |
