Dokument: P-Loop ATPases - Csn2 from Streptococcus agalactiae and the human liver ABC transporter BSEP

Titel:	P-Loop ATPases - Csn2 from Streptococcus agalactiae and the human liver ABC transporter BSEP
Weiterer Titel:	P-Loop ATPasen - Csn2 aus Streptococcus agalactiae und der humane Leber ABC Transporter BSEP
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=26158
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20130716-105759-8
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Ellinger, Philipp [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 55,18 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 30.06.2013 / geändert 30.06.2013
Beitragende:	Prof. Dr. Schmitt, Lutz [Gutachter] Prof. Dr. Kubitz, Ralf [Gutachter]
Stichwörter:	P-loop, CRISPR, ABC Transporter, Leber, Membranprotein, BSEP
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 540 Chemie
Beschreibungen:	Phosphatbindende-Schleife (P-Loop) Proteine sind ubiquitär und an zahlreichen biochemischen Funktionen beteiligt. Diese reichen von Signaltransduktionsprozessen, dem Transport von Molekülen oder Ionen über biologische Membranen bis hin zur Translation von Proteinen und DNA Reparaturmechanismen. Ihre Gemeinsamkeit ist das Vorhandensein des P-Loops. Der P-Loop (auch „Walker A“ Motiv genannt) ist eine Glycin-reiche Schleife, die für die Bindung des Triphosphats von Nukleotiden wie ATP oder GTP verantwortlich ist. Ein weiteres Motiv, das „Walker B“ Motiv kommt gemeinsam mit dem P-Loop in demselben Protein vor und ist an der Hydrolyse dieser Nukleotide beteiligt. 10-18 % aller sequenzierten Genome codieren für P-Loop enthaltende Proteine. Diese Dissertation beschäftigt sich mit zwei P-Loop Proteinen, dem ATP-bindenden Kassette Transporter (ABC Transporter) bile salt export pump (BSEP, ABCB11), der den Transport von Gallensalzen über die kanalikuläre Membran von Hepatozyten vermittelt, sowie mit Csn2. Csn2 ist Bestandteil des clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated Systems (CRISPR/Cas-System), einem bakteriellen, adaptiven Immunsystem. Die ersten beiden Kapitel beschäftigen sich mit Csn2 aus Streptococcus agalactiae. Das CRISPR/Cas-System ist ein adaptives Immunsystem, das auf der Integration von kurzen, nicht-Wirt-Nukleinsäurefragmenten in einen speziellen genomischen Lokus, dem CRISPR Lokus, beruht. Dieser Lokus wird nachfolgend transkribiert und die erhaltende RNA weiter in kleine CRISPR-RNAs (crRNAs) prozessiert. Diese crRNAs dienen als Sonde zum Auffinden von fremder Nukleinsäure, welche dann in einem RNA-Interferenz ähnlichen Mechanismus zerstört wird. Csn2 ist an der Integration fremder Nukleinsäurefragmente in den CRISPR Lokus beteiligt. Der zugrunde liegende Mechanismus der Integration ist nur rudimentär verstanden. Um daher die Rolle von Csn2 im Integrationsmechanismus zu klären, wurden strukturelle und biochemische Methoden angewandt. Zunächst konnte mit Hilfe der Röntgenstrukturanalyse die dreidimensionale, räumliche Struktur von Csn2 mit einer Auflösung von 2.0 Å bestimmt werden. Csn2 besitzt eine „Ring“-ähnliche, tetramere Struktur mit einem Loch in der Mitte, sowie einen P-Loop und ein „Walker B“ Motiv, die auf Aminosäureebene jedoch degeneriert sind. Es konnte weder die Bindung noch die Hydrolyse von Nukleotiden gezeigt werden, jedoch war Csn2 in der Lage doppelsträngige DNA Calcium-abhängig und Sequenz-unspezifisch zu binden. Weitere Analysen zeigten, dass Csn2 freie DNA Enden benötigt, die durch die freie Mitte von Csn2 eingefädelt werden können. Dieses Bindeverhalten ähnelt dem Bindeverhalten des Ku Proteins, einem Protein, das sowohl bei Pro- wie auch Eukaryonten am nicht-homologen Endjoining beteiligt ist. Daher wird ein ähnlicher Mechanismus für Csn2 bei der Integration von fremden Nukleinsäurefragmenten im CRISPR/Cas-System postuliert. Kapitel drei bis sieben beschäftigen sich mit dem Leber-lokalisierten P-Loop ABC Transporter BSEP. BSEP nutzt die Energie der ATP-Hydrolyse zum Transport von Gallensalzen über biologische Membranen. Mutationen im BSEP Gen können zu schweren, cholestatischen Krankheiten führen, deren letzte Therapiemöglichkeit die Lebertransplantation ist. Um das humane BSEP in vitro zu charakterisieren, wurde eine Klonierungs- und Mutagenesestrategie für die instabile cDNA von BSEP entwickelt und etabliert. Mit dieser Strategie war es möglich BSEP für das Pichia pastoris Überexpressionssystem zu klonieren und BSEP zum ersten Mal rekombinant in P. pastoris herzustellen. Für die Isolierung von BSEP aus P. pastoris Membranen wurden über 100 verschiedene Detergenzien getestet, um adequate Detergenzien für die weitere Aufreinigung zu identifizieren. In Detergenzlösung war BSEP in der Lage an Nukleotide zu binden. Somit konnten die Expression, Reinigung, sowie erste Bindestudien für humanes BSEP erfolgreich etabliert werden. Weiterhin wurde ein vesikulärer Transport-Funktionstest etabliert, der auf P. pastoris Plasmamembranen beruht, die BSEP enthalten. Die Michaelis-Menten Konstanten für zwei Gallensalze ähnelten den bereits publizierten Daten, die mit anderen Expressionssystemen erhalten wurden. Mit Hilfe dieses Systems, sowie der Klonierungs- und Mutagenesestrategie war es möglich eine klinisch relevante BSEP Mutation, BSEP G374S, zu charakterisieren. Der Transport von Gallensalzen durch das mutierte BSEP war drastisch reduziert, sodass die cholestatischen Symptome des Patienten mit dieser BSEP Mutation durch einen Transportdefekt zu erklären sind. In dieser Arbeit wurden zwei Proteine charakterisiert, die als gemeinsames Motiv den P-Loop aufweisen, was die Bedeutung des P-Loops als strukturelles Element in vielen verschiedenen Proteinen mit diversen Funktionen unterstreicht. Phosphate-binding loop (P-loop) containing proteins are ubiquitous proteins which fulfill diverse biochemical functions. These range from involvement in signal transduction, transport of substances across membranes to protein translation and DNA repair. The common ground of almost all these proteins is the P-loop. The P-loop (also called “Walker A“ motif) is a glycine-rich loop responsible for binding the triphosphate moiety of nucleotides like ATP or GTP. Another highly conserved motif, the “Walker B” motif, is found together with the P-loop and is involved in nucleotide hydrolysis. 10-18 % of all sequenced genomes encode for P-loop harboring proteins. This doctoral thesis is dedicated to two P-loop proteins, the ATP-binding cassette (ABC) transporter bile salt export pump (BSEP, ABCB11) involved in the transport of bile salts across the membrane of hepatocytes in the human liver and Csn2, a protein involved in an inheritable, adaptive immune system of bacteria called clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated-system (CRISPR/Cas-system). The first two chapters of this doctoral thesis deal with the Cas protein Csn2 from Streptococcus agalactiae. The CRISPR/Cas-system is an adaptive, bacterial immune system which relies on the integration of small fragments of foreign nucleic acids into a specific locus in the genome of bacteria, the CRISPR array. This array is subsequently transcribed and the resulting RNA is matured into small CRISPR-RNAs (crRNAs) and foreign nucleic acids are destroyed by an RNA-interference-like mechanism using the crRNAs as probe. To elucidate the function of Csn2 in the obscure integration mechanism of foreign nucleic acids into the CRISPR array, structural and biochemical techniqus were employed. First, the three-dimensional structure of Csn2, using X-ray crystallography, was solved to 2.0 Å resolution. Csn2 is a ring-shaped, stable tetramer with a conserved structural P-loop and “Walker B” motif, which are degenerated on the amino acid sequence level. Neither binding nor hydrolysis of nucleotides could be measured, but Csn2 showed a calcium-dependent binding of double-stranded DNA (dsDNA) in a sequence-unspecific manner. Further biochemical analysis revealed that dsDNA gets threaded into the inner hole of Csn2 on free DNA ends. This behavior is similar to the Ku protein involved in pro- and eukaryotic non-homologous end-joining (NHEJ) and therefore a model for the Csn2 role in foreign nucleic acid integration is proposed. Chapters three to seven are dedicated to the human ABC transporter BSEP. This P-loop containing membrane transporter utilizes the energy of ATP hydrolysis to transport bile salts across membranes. Mutations within its gene can cause severe cholestatic diseases requiring the ultimate therapy of liver transplantation. To characterize human BSEP in vitro, a cloning and mutagenesis strategy for the instable BSEP cDNA was established. With this approach, an overexpression of human BSEP at high levels in the methylotrophic yeast Pichia pastoris was possible and allowed its purification in milligram quantities for the first time. For the purification, a set of over 100 different detergents was screened to identify detergents, which were able to solubilize BSEP out of the yeast membrane. BSEP was able to bind to nucleotides in detergent solution. Furthermore, a vesicular uptake assay relying on P. pastoris plasma membranes expressing human BSEP was established. The Michaelis-Menten constants for bile salts were similar to published data. With the help of this method, a clinically relevant BSEP mutation, the BSEP G374S mutation could be investigated, showing a reduced transport. The mutation likely affected the substrate-binding site and the transport assay explained the patient’s symptoms. In summary, two complete different P-loop containing proteins could be characterized, showing the importance of this “small” structural element once again.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Chemie » Biochemie
Dokument erstellt am:	16.07.2013
Dateien geändert am:	16.07.2013
Promotionsantrag am:	07.05.2013
Datum der Promotion:	15.07.2013