Dokument: Charakterisierung der neuen, potentiellen Adhäsine Yaa1, Yaa2 und Yaa3 von Chlamydia pneumoniae

Titel:	Charakterisierung der neuen, potentiellen Adhäsine Yaa1, Yaa2 und Yaa3 von Chlamydia pneumoniae
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=25996
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20130614-100113-5
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Fechtner, Tim [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 14,21 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 13.06.2013 / geändert 13.06.2013
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Chlamydia sind Gram-negative, obligat intrazelluläre Bakterien, die phylogenetisch sehr stark von allen anderen Eubakterien abgegrenzt sind. Zu den humanpathogenen Chlamydien gehören C. pneumoniae und C. trachomatis. C. pneumoniae verursacht akute Infektionen der oberen und unteren Atemwege und wird außerdem mit chronischen Erkrankungen wie Asthma und chronisch obstruktiver Lungenerkrankung (COPD) in Verbindung gebracht. Praktisch jeder Mensch durchläuft in seinem Leben mindestens eine C. pneumoniae Infektion. Die verschiedenen C. trachomatis Serovare infizieren die Augen und den Urogenitaltrakt. Infektionen des Auges können zur Ausbildung eines Trachoms führen und sind der Hauptgrund vermeidbarer Blindheit, während Infektionen des Urogenitaltraktes weltweit die häufigste bakterielle Ursache sexuell übertragbarer Krankheiten sind. Chlamydien durchlaufen einen einzigartigen biphasischen Lebenszyklus und wechseln zwischen zwei distinkten Lebensformen. Das Elementarkörperchen (EB) stellt die infektiöse, metabolisch inaktive Form dar, während das Retikularkörperchen nicht infektiös ist, jedoch metabolisch aktiv und daher die replizierende Form darstellt. Der initiale Schritt der Infektion ist die Adhäsion der EBs an die Wirtszelle und die folgende, bakterienvermittelte Internalisierung. Die C. pneumoniae EBs interagieren höchstwahrscheinlich zunächst über das Adhäsin OmcB mit Glykosaminoglykanen der Wirtszelle und gelangen entlang der polymeren GAG-Strukturen auf der Oberfläche der Humanzelle zu ihrer spezifischen Eintrittspforte. Hier wird dann die Adhäsion des EBs über die Interaktion der Pmp-Proteine mit humanen Rezeptoren vermittelt. Werden beide Adhäsionswege blockiert, so ist dennoch eine Restinfektion von 40 % zu beobachten. Somit nutzt C. pneumoniae, ebenso wie viele andere Pathogene, ein breites Repertoire an Adhäsinen um effizient an die Wirtszelle zu binden. In einer vorausgegangenen Studie nach neuen, potentiellen Adhäsinen wurden den hypothetischen, chlamydialen Proteinen Yaa1, Yaa2 und Yaa3 (yet another adhesin) adhäsive Eigenschaften zugeordnet. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, diese potentiellen Adhäsine zu charakterisieren und ihre Funktion im Infektionszyklus zu beschreiben. Für die funktionelle Analyse von Yaa1, Yaa2 und Yaa3 war die Expression und Aufreinigung von rekombinantem Protein essentiell. Da im Rahmen dieser Arbeit alle Versuche fehlschlugen Yaa3 rekombinant herzustellen, wurde dessen Funktionsanalyse nicht weiter verfolgt. Polyklonale Antikörper gegen das Yaa2-Protein neutralisierten die chlamydiale Infektion nur schwach, während rekombinantes Yaa2 die Infektion um etwa 30 % reduzierte. Die im Hefe-System beschriebenen adhäsiven Eigenschaften von Yaa2 konnten mit rekombinantem Protein allerdings nicht bestätigt werden. Damit ist fraglich, ob es sich bei Yaa2 um ein weiteres, chlamydiales Adhäsin handelt. Polyklonale Antikörper gegen das Yaa1-Protein detektierten das Protein auf der Oberfläche von chlamydialen EBs. Die postulierten adhäsiven Eigenschaften von Yaa1 wurden in Adhäsionsexperimenten mit rekombinantem Protein bestätigt. Die Yaa1-Bindedomäne konnte auf den C terminalen Bereich des Proteins (Aminosäure 305 bis 355) eingegrenzt werden. Bei der Bindung an die Humanzelle interagierte rYaa1 direkt mit der Phospholipidmembran. Zudem neutralisierten anti-Yaa1 Antikörper die Infektion signifikant. Überraschenderweise neutralisierte rYaa1 die chlamydiale Infektion nicht, sondern führte zu einer verbesserten Infektion von bis zu 300 %. Für die infektionssteigernde Wirkung von rYaa1 war sowohl die Bindung über den C Terminus als auch der N-Terminus nötig, dessen genaue Funktion noch beschrieben werden muss. Diese stimulierende Wirkung auf die Infektion beruhte erstaunlicherweise nicht auf einer verbesserten Adhäsion, sondern einer verbesserten Internalisierung der EBs. Im Detail konnte gezeigt werden, dass rYaa1 auf frühe Prozesse der Internalisierung wirkt und hierbei von Lipid Rafts und einem intakten Aktinzytoskelett abhängig ist. Damit handelt es sich bei Yaa1 nicht um ein klassisches Adhäsin, sondern um ein Protein, dass an der Internalisierung beteiligt ist. Die durch rYaa1 vermittelte, effizientere Endozytose des EBs ist ein spezifischer Prozess, denn es erhöhte die generelle Endozytose der Humanzelle nicht. Überraschenderweise hatte das C. pneumoniae spezifische rYaa1 auch einen verstärkenden Effekt auf die Infektion von C. trachomatis Serovar E, nicht jedoch auf die des L2-Serovars. Die Bedeutung von Lipid Rafts für die C. pneumoniae Infektion konnte in dieser Arbeit erstmals mikroskopisch bestätigt werden. So wurde eine Akkumulation von Lipid Rafts an der EB-Eintrittsstelle nachgewiesen. Auch die frühe Einschlussmembran ist eine Stunde nach der Infektion angereichert mit Lipid Rafts, welche darüber hinaus auch eine Anreicherung des C. pneumoniae-spezifischen Rezeptors EGFR aufwies. Auch rYaa1 lokalisierte spezifisch an Lipid Rafts, jedoch war die Bindung von rYaa1 an die Membran der Humanzelle unabhängig von der Integrität der Lipid Rafts. Zusammenfassend wurde mit Yaa1 ein neues, für die C. pneumoniae Infektion essentielles Protein identifiziert, welches neue Einblicke in die bis dato wenig verstandenen Endozytoseprozesse liefert. Chlamydia are Gram negative, obligate intracellular bacteria that are phylogenetically very well separated from all other eubacteria. C. pneumoniae and C. trachomatis are important human pathogens. C. pneumoniae causes acute infections of the upper and lower respiratory tract, but has also been linked to chronic diseases like the asthma and chronic obstructive pneumonia disease (COPD). During his life, nearly everybody undergoes at least one C. pneumoniae infection. The different C. trachomatis serovars infect the eyes and the urogenital tract. Infections of the eyes cause a disease called Trachom and are the leading cause of preventable blindness worldwide, whereas infections of the urogenital tract are the leading cause of sexually transmitted bacterial diseases worldwide. Chlamydia undergoes a unique biphasic life cycle and changes between two distinct forms. The elementary body (EB) is the infectious but metabolically inactive form. The reticulate body (RB) is not infectious but metabolically active and thus the replicative form. The adhesion of the EB to the host cell and the subsequent bacteria-driven internalization are the initial steps of the infection. The first interaction is mediated by the chlamydial adhesin OmcB that interacts with glycosaminoglycans on the surface of the human cell. Most likely, the EBs can surf along the surface of the host cell via the polymeric GAGs to the specific port of internalization. Here, the adhesion is enforced by the interaction of the chlamydial Pmp proteins that interact with a human protein. If both adhesion pathways are blocked, this results in a decrease of infection to 40 %, indicating that C. pneumoniae, like many other pathogens, uses a wide repertoire of adhesion molecules. Thus, in a previous study, we searched for new potential adhesins and found the hypothetical, chlamydial proteins Yaa1, Yaa2 and Yaa3 (yet another adhesin) having adhesive abilities. The aim of this work was to characterize the potential adhesins and describe their role in the chlamydial infection. To functionally analyze Yaa1, Yaa2 and Yaa3 the expression and purification of recombinant protein was essential. As all attempts to generate recombinant Yaa3 protein have been not successful the functional characterization of Yaa3 was not pursued. Polyclonal antibodies raised against Yaa2 had weak neutralizing abilities, while recombinant Yaa2 reduced the infection by 30 %. In contrast, the adhesive abilities of Yaa2, observed in the yeast display system, could not be confirmed using recombinant protein. Thus, it remains questionable if Yaa2 is a new chlamydial adhesin. Polyclonal antibodies raised against Yaa1 could detect Yaa1 on the surface of EBs. The proposed adhesive abilities could be confirmed in different experiments using recombinant protein. The binding domain of Yaa1 was addressed to the C-terminal part (amino acids 305 to 355). The binding of rYaa1 was shown to be mediated by direct interaction with the plasma membrane of the human cell. Additionally, anti-Yaa1 antibodies neutralized the infection significantly. Surprisingly, rYaa1 did not neutralize the chlamydial infection but boosted the infection up to 300 %. This boosting effect of rYaa1 was shown to be dependent on the binding of the C-terminal domain, but also the N-terminal domain was necessary. The precise function of the N-terminal domain still needs to be elucidated. Interestingly, the boosting of the infection by rYaa1 was not due to an enhanced adhesion of the EBs but due to a more efficient internalization. In detail, it could be shown that rYaa1 acts at early steps of internalization and its function is dependent on the integrity of lipid rafts and the actin cytoskeleton. Thus, Yaa1 is not a new classical adhesin, but a protein that is involved in the internalization of the EB. The enhanced endocytosis of the EB, mediated by rYaa1, was shown to be a specific process as it did not enhance endocytosis in general. Interestingly, the C. pneumoniae specific rYaa1 also boosted the C. trachomatis serovar E infection but not the infection of the L2 serovar. The involvement of lipid rafts in the C. pneumoniae infection was proven microscopically for the first time. It could be shown that lipid rafts accumulate at the entrance port of the EBs and that the early inclusion one hour post infection is enriched in lipid rafts. Additionally, an accumulation of the C. pneumoniae specific receptor EGFR co-localized with clustered lipid rafts. Recombinant Yaa1 also localized specifically at lipid rafts but the binding of rYaa1 to the plasma membrane of the human cell was independent of the integrity of lipid rafts. In summary, Yaa1 was identified to be a new protein that is essential for the C. pneumoniae infection and provides new insights into the little-understood endocytosis of the chlamydial EB.
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Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » Funktionelle Genomforschung der Mikroorganismen
Dokument erstellt am:	14.06.2013
Dateien geändert am:	14.06.2013
Promotionsantrag am:	19.12.2012
Datum der Promotion:	29.01.2013