Dokument: Fluoreszenzreporterproteine als Werkzeuge in der Biotechnologie

Titel:	Fluoreszenzreporterproteine als Werkzeuge in der Biotechnologie
Weiterer Titel:	Fluorescent reporter proteins as tools in biotechnology
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=25986
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20130613-140421-2
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Scholz, Kathrin [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 4,78 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 13.06.2013 / geändert 13.06.2013
Beitragende:	Prof. Dr. Jaeger, Karl-Erich [Gutachter] PD Dr. Pohl, Martina [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Recently, the use of non-conventional reaction media such as organic solvents, ionic liquids and supercritical fluids, has become an industrially attractive alternative to conventional biotransformation carried out in aqueous media. However, due to their physicochemical properties, these reaction media are highly demanding for the employed biocatalyst. Their use often leads to rapid inactivation of the enzyme in the reaction system, resulting in sub-optimal yields and/or poor optical purity of the desired product. Therefore, it is of particular interest to understand the molecular basis for the loss of enzymatic activity. Here, translational fusion proteins consisting of a fluorescent reporter protein (FRP) and the respective enzyme, could be used as a non-invasive tool to track the fate of the enzyme in the reaction system. In this way, the respective fluorescent fusion enzyme can be traced, during biocatalysis, by using microscopic and spectroscopic methods. To investigate the suitability of various FRPs for the use as a translational fusion partner, fusion proteins consisting of different FRPs and various complex enzyme systems were generated. Hereby, in all cases, the well studied yellow fluorescent protein (YFP) was used as a reference fusion partner. Similarly, a less well studied flavin-based fluorescent protein (FbFP) and a protein of the photoactive yellow protein (PYP) family were tested for their suitability as fusion-FRP. As target enzymes, the monomeric lipase A from Bacillus subtilis (BsLA), the dimeric hydroxynitrile Lyase from Arabidopsis thaliana (AtHNL) and the tetrameric cofactor-dependent benzaldehyde lyase from Pseudomonas fluorescens Biovar I (Pf BAL) were used. Hereby, the target enzymes were selected based on their structural complexity (quaternary structure, cofactor-dependence) to verify wide applicability of the employed FRPs. Moreover, for all selected target enzymes, the use of non-conventional reaction media can broaden their biocatalytic scope. In the presented study, the suitability of FbFPs as a fluorescent fusion partner was demonstrated. The FbFP based on the light, oxygen, voltage (LOV) domain of the B. subtilis YtvA photoreceptor could, in most cases, be fused N- and C-terminally to the above mentioned enzymes, without loss of FbFP fluorescence and target enzymatic activity. Additionally, a fusion protein consisting of the H. halophila PYP and the AtHNL was generated. The resulting purified apo-protein was reconstituted with a strongly fluorescent p-Hydroxy-cinnamic acid analogue. The resulting fluorescent fusion protein was used as a reference construct for investigation of the FRP-AtHNL fusion system. The fusion system consisting of various FRPs and the AtHNL was subsequently characterized in more detail. Surprisingly, both FbFP-AtHNL fusion proteins showed a strong increase in enzymatic activity and stability in the weakly acidic pH range (pH < 4.75) compared to the wild-type AtHNL. The wild-type AtHNL, the YFP-AtHNL and the PYP-AtHNL fusion-proteins are unstable at those pH values. While HPLC-based size exclusion chromatographic studies showed that the three latter constructs are predominantly dimeric, the most stable fusion protein (cFbFP-AtHNL) exists largely in tetrameric form. Thus, the FbFP-induced change in quaternary structure could be a reason for the improved stability of the FbFP-AtHNL fusion proteins. The pH-stability of cFbFP-AtHNL enabled efficient synthesis of (R)-mandelonitrile in an aqueous-organic two-phase system. In contrast, at pH values below pH 5, the wild-type AtHNL is not stable and hence can not be used. Finally, the FbFP-AtHNL fusion system was used to investigate a biotechnologically relevant non-conventional reaction system. Recombinant AtHNL and FbFP-AtHNL expressing E. coli - BL21(DE3)-cells were used as biocatalyst for the synthesis of various chiral cyanohydrins in microaqueous monophasic methyl tert-butyl ether (MTBE). By using lyophilized (dry) cells, most products could be obtained in high enantiomeric purity. Furthermore, fluorescence microscopy revealed cell shrinkage by about 20 % during three consecutive reaction cycles in MTBE. At the same time, fluorimetric studies using whole cells indicated that cellular- and fusion protein integrity was essentially retained during incubation in the reaction system. In den letzten Jahren hat die Verwendung von unkonventionellen Reaktionsmedien, wie organischen Lösungsmitteln, ionischen Flüssigkeiten oder superkritischen Fluiden, verstärkt Einzug in die Biokatalyse gehalten. Diese Reaktionsmedien stellen jedoch aufgrund ihrer physikochemischen Eigenschaften hohe Anforderungen an den verwendeten Biokatalysator. Häufig kommt es hierbei zu einer raschen Inaktivierung des Enzyms im Reaktionssystem, was zu suboptimalen Ausbeuten und/oder einer schlechten Enantiomerenreinheit des Produkts führt. Daher ist es von besonderem Interesse, die molekularen Ursachen für die Inaktivierung des Enzyms zu kennen. Als nicht-invasives Hilfsmittel bietet sich hierbei der Einsatz von Fusionsproteinen, bestehend aus einem Fluoreszenzreporterprotein (FRP) und dem zu untersuchenden Enzym an. So kann das erzeugte fluoreszente Fusionsenzym vor, während und nach der Biokatalyse im Reaktionssystem mittels mikroskopischer- und spektroskopischer Methoden beobachtet und untersucht werden. Um die Eignung verschiedener FRPs für den Einsatz als translationeller Fusionspartner zu untersuchen, wurden Fusionsproteine, bestehend aus verschiedenen FRPs und unterschiedlich komplexen Enzymen, erzeugt. Als bereits gut untersuchtes FRP wurde das gelb fluoreszente Protein (YFP) als Referenz-Fusionspartner verwendet. Weniger gut untersuchte FRPs, wie ein Flavin-basiertes, fluoreszentes Protein (FbFP), sowie ein Protein der photoactive yellow protein (PYP)-Familie wurden hinsichtlich ihrer Eignung als Fusions-FRP evaluiert. Als Zielenzyme wurden verschieden komplexe Enzyme, wie die monomere Lipase A aus Bacillus subtilis (BsLA), die dimere Hydroxynitril Lyase aus Arabidopsis thaliana (AtHNL) und die tetramere Kofaktor-abhängige Benzaldehyd Lyase aus Pseudomonas fluorescens Biovar I (Pf BAL) verwendet. Die Zielenzyme wurden hinsichtlich unterschiedlicher Komplexität (Quartärstruktur, Kofaktorabhängigkeit) ausgewählt, um eine möglichst breite Anwendbarkeit des FRPs zu verifizieren. Außerdem eröffnet der Einsatz unkonventioneller Reaktionsmedien für alle ausgewählten Enzym-Systeme neue biokatalytische Möglichkeiten. Insbesondere für FbFPs konnte die Eignung als fluoreszenter Fusionspartner nachgewiesen werden. Diese Eigenschaft wurde bisher nur unzureichend untersucht. Das hier verwendete FbFP, basierend auf der light, oxygen, voltage (LOV)-Domäne des B. subtilis YtvA-Photorezeptors, konnte in den meisten Fällen sowohl N- als auch C-terminal, ohne Verlust von FbFP-Fluoreszenz und enzymatischer Zielenzym-Aktivität mit dem jeweilige Zielenzym fusioniert werden. Zusätzlich konnte ein Fusionsprotein bestehend aus dem H. halophila PYP und der AtHNL erzeugt und in vitro mit einem stark fluoreszenten p-Hydroxyzimtsäure-Analogon beladen werden. Das entsprechende Fusionsprotein wurde als Referenzkonstrukt zur Untersuchung des FRP-AtHNL-Fusionssystems eingesetzt. Das Fusionssystem bestehend aus den verschiedenen FRPs und der AtHNL wurde zudem eingehender charakterisiert. Beide FbFP-AtHNL-Fusionen besaßen überraschenderweise im schwach sauren pH-Bereich (< pH 4,75) eine im Vergleich zur wildtypischen AtHNL stark erhöhte Aktivität und Stabilität. Die wildtypische AtHNL, sowie die YFP-AtHNL- und die PYP-AtHNL-Fusionen sind in diesem pH-Bereich instabil. Mittels HPLC-basierter Größenausschlusschromatographie konnte nachgewiesen werden, dass die wildtypische AtHNL, das YFP-AtHNL-, sowie das PYP-AtHNLFusionsprotein vorwiegend als Dimer vorliegen. Im Gegensatz dazu ist die stabilste Fusion cFbFPAtHNL ein Tetramer. Die veränderte Quartärstruktur könnte somit eine Ursache für die erhöhte Stabilität der FbFP-Fusionsproteine sein. Die pH-Stabilität der FbFP-Fusionen erlaubte zudem die Synthese von (R)-Mandelonitril in einem wässrig-organischen Zweiphasensystem. Aufgrund der geringen Stabilität der AtHNL bei pH-Werten unter pH 5, kann die wildtypische AtHNL unter diesen Bedingungen nicht eingesetzt werden. Abschließend wurde eine FbFP-AtHNL-Fusion zur Untersuchung eines biotechnologisch relevanten, unkonventionellen Reaktionssystems herangezogen. Hierfür wurden rekombinante AtHNL und FbFP-AtHNL produzierende E. coli -BL21(DE3)-Zellen als Biokatalysator in mikro-wässrigem, monophasischem Methyl-tert-Butylether (MTBE) zur Synthese verschiedener chiraler Cyanhydrine eingesetzt. Unter Verwendung lyophilisierter (trockener) Zellen konnten die meisten Produkte in hoher Enantiomerenreinheit erhalten werden. Ferner konnte mit Hilfe von fluoreszenzmikroskopischen und spektroskopischen Methoden, welche durch Verwendung des FbFP-AtHNL-Fusionsproteins erst möglich wurden, gezeigt werden, dass die Zellen im Verlauf der Inkubation in MTBE um ca. 20 % schrumpften. Sowohl die zelluläre- als auch die Fusionsprotein-Integrität bleibt jedoch bei Inkubation in nahezu wasserfreien MTBE erhalten.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät
Dokument erstellt am:	13.06.2013
Dateien geändert am:	13.06.2013
Promotionsantrag am:	11.05.2012
Datum der Promotion:	28.06.2012