Dokument: Regulatorische Mechanismen der unkonventionellen Rho-GTPase Wrch1 in der Signaltransduktion

Titel:	Regulatorische Mechanismen der unkonventionellen Rho-GTPase Wrch1 in der Signaltransduktion
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=25905
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20130605-103113-1
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Riße, Sarah [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 5,04 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 05.06.2013 / geändert 05.06.2013
Beitragende:	Prof. Dr. Ahmadian, Reza [Gutachter] Prof. Dr. Willbold, Dieter [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Die untypische GTPase Wrch1/RhoU gehört zu der Gruppe der Cdc42-ähnlichen Guaninnukleotid-bindenden Proteine und ist somit ein Mitglied der Rho-GTPasen, unterscheidet sich jedoch deutlich von anderen Mitgliedern dieser Proteinfamilie. Neben der Guaninnukleotid-bindenden G-Domäne weist Wrch1 N- und C-terminal zusätzliche Aminosäuren auf, die für dessen Funktion von großer Bedeutung sind. Der N-Terminus beinhaltet Prolin-reiche Sequenzbereiche, die bekanntermaßen an SH3-Domänen binden können. Des Weiteren scheint der N-Terminus eine autoin-hibitorische Funktion auszuüben, indem er mit der eigenen G-Domäne interagiert. Bisher ist nur wenig über diese GTPase sowie ihre Funktion und Regulation bekannt. Deswegen stand die Charakterisierung intra- und intermolekularer Proteininteraktionen von Wrch1 im Mittelpunkt dieser Arbeit. Der Einfluss des N-Terminus auf die intrinsischen Eigenschaften der G-Domäne wurde mittels fluoreszenzspektroskopischer Methoden analysiert. Es stellte sich heraus, dass Wrch1 eine geringe Nukleotidaffinität besaß, wodurch ein Nukleotid-austausch erschwert wurde und größtenteils in inaktivem Protein resultierte. Deswegen konnten weder die Nukleotidassoziation noch die Dissoziation mittels biochemischer Verfahren bestimmt werden. Die intrinsische GTP-Hydrolyse konnte jedoch nach Nukleotidaustausch mittels der EDTA-Methode gemessen werden. Hieraus konnte geschlossen werden, dass die Hydrolyserate von Wrch1 geringer war als bei dem verwandten Protein Cdc42, und dass hierbei der eigene N-Terminus keinen Einfluss auf diese Reaktion hatte. Um intermolekulare Eigenschaften von Wrch1 besser zu verstehen, wurden bisher wenig charakterisierte Interaktionen mit Effektoren und Adaptoren untersucht. Von den drei möglichen Effektoren PAK1, Pyk2 und N-WASp konnte hierbei nur PAK1 eindeutig als Interaktionspartner von Wrch1 bestimmt werden. Des Weiteren konnte in dieser Arbeit mittels verschiedener Methoden gezeigt werden, dass die eingesetzten Adapterproteine über ihre SH3-Domänen mit dem N-Terminus von Wrch1, der drei PxxP-Motive enthält, interagieren. Wrch1 bindet in vitro an die isolierten SH3-Domänen von Grb2 (N- und C-terminale SH3-Domäne), Nck1 (mittlere und C-terminale SH3-Domäne), Crk1, Src und p120, wobei die Affinitäten der einzelnen Interaktionen als niedrig affin eingestuft werden können. Interessanterweise konnte jedoch nur das mittlere der drei PxxP-Motive von Wrch1 mit den SH3-Domänen interagieren, nicht jedoch das N- oder C-terminale PxxP- Zusammenfassung 121 Motiv. Hierbei sind acht Aminosäuren (APPVPPRR) für eine Bindung ausreichend, wobei das mittlere PxxP-Motiv von Wrch1, aufgrund eines für die Bindung essentiellen C-terminalen Arginins, zur Klasse II der an SH3-Domänen bindenden Liganden gezählt werden kann. Chp, ein Wrch1-verwandtes Protein, das ebenfalls einen Prolin-reichen N-Terminus besitzt, konnte hingegen nur mit der SH3-Domäne von Src und der N-terminalen SH3-Domäne von Grb2 interagieren, nicht aber mit den anderen untersuchten SH3-Domänen von Grb2, Nck1, Crk und p120, die in dieser Arbeit als Bindungs-partner von Wrch1 identifiziert wurden. Somit liegen deutliche Unterschiede zwischen den beiden GTPasen Chp und Wrch1, in ihrer Fähigkeit mit Adapter-proteinen zu interagieren, vor. Die isolierte SH3-Domänen von Grb2, Nck1, Src, Crk1, und p120 wiesen in ITC-Messungen und Affinitätspräzipitations-Experimenten eine niedrige Affinität gegenüber ihrem Interaktionspartner Wrch1 auf. Interessanterweise konnte eine starke Bindung zwischen Wrch1 und endogenem Grb2 und Nck, nicht aber Src, Crk1 oder p120, aus Zelllysaten festgestellt werden. Diese hohe Affinität konnte in vitro durch ITC-Experimente mit dem N-Terminus von Wrch1 und full length Grb2 und Nck1 verifiziert werden. Hierbei wird anscheinend die geringe Affinität der SH3-Domänen durch die hohe Avidität der full length Adapterproteine kompensiert, die simultan über beide SH3-Domänen mit Wrch1 interagieren können. Die Funktion von Wrch1 in der Signaltransduktion scheint somit abhängig zu sein von der Fähigkeit SH3-Domänen zu binden und mit verschiedenen Effektoren in Multiproteinkomplexen zu interagieren, wobei PAK1, Grb2 und Nck als physiologische Interaktionspartner von Wrch1 in Frage kommen. The atypical GTPase Wrch1/RhoU belongs to the family of Cdc42-like guanine nucleotide-binding proteins and as such it is a member of the Rho-GTPases. Wrch1 is different from other proteins of this family because it contains beside the G-domain N- and C-terminal extensions important for its cellular function. The N-terminus of Wrch1 contains proline-rich sequences, which are known as SH3 domain-binding motifs. Another function of the N-terminus seems to be the autoinhibition of the G-domain of Wrch1. Up to now, only little is known about this GTPase, its function and regulation. Therefore, the aim of this thesis was to analyse and understand the intra- and intermolecular protein interactions of Wrch1. The effects of the Wrch1 N-terminus on the intrinsic properties of the G-domain were analysed using fluorescence-based methods. Wrch1 turned out to exhibit a low affinity for the bound nucleotides whereby the nucleotide exchange was hindered. Accordingly, the protein was mostly inactive. Thus, the nucleotide association and dissociation could not be determined. The intrinsic GTP-hydrolysis was measured after nucleotide exchange via the EDTA-method and showed that the rate of hydrolysis of Wrch1 was lower compared to the closely related protein Cdc42. Additionally, it could be shown that the N-terminus of Wrch1 did not affect the intrinsic GTP-hydrolysis. For a better understanding of the intermolecular properties of Wrch1, its interactions with effectors and adaptors were characterized. Of the three possible effectors, PAK1, Pyk2 and N-WASp, only PAK1 could be clearly determined as a binding partner of Wrch1. The N-terminus of Wrch1 containing three PxxP motifs interacts with SH3 domains of different adaptor proteins. Here, employing different methods, it could be demonstrated that in vitro Wrch1 bound to isolated SH3 domains of Grb2 (N- and C-terminal SH3 domain), Nck1 (middle and C-terminal SH3 domain), Crk1, Src, and p120 where the affinities determined by different measurements revealed rather low-affinity interactions. Interestingly, it could be shown, that only the central of the three PxxP motifs of Wrch1 is responsible for the interaction with the investigated SH3-domains, and no binding could be detected for the N- or C-terminal PxxP motif of Wrch1. Here, eight amino acids (APPVPPRR) of Wrch1 are sufficient for SH3-binding. The central Zusammenfassung 123 PxxP motif of Wrch1 contains an essential C-terminal arginine and thus belongs to the class II of SH3 domain-binding ligands. Chp, a protein closely related to Wrch1 contains also a proline-rich N-terminus. Interestingly, Chp bound only to the SH3 domain of Src and the N-terminal SH3-domain of Grb2 and not to the other SH3 domains of Grb2, Nck1, Crk1, and p120, which have been identified in this study as Wrch1 binding partners. Thus, there are clear differences between the two GTPases Chp and Wrch1 in their interacting properties regarding adaptor proteins. Using sedimentation and isothermal titration calorimetric (ITC) measurements isolated SH3 domains of Grb2, Nck1, Src, Crk1, and p120 were identified as low-affinity Wrch1-binding partners. Interestingly, under cell-based conditions nWrch1 bound tightly to endogenous Grb2 and Nck, but not to Crk, Src or p120. Consistent with this, a very tight nWrch1 interaction with full-length Grb2 and Nck1 was confirmed in vitro by ITC measurements indicating that high avidity of the adaptor proteins can compensate for the low affinity of their SH3 domains. Taken together, novel functional insights from this study suggest that multiple upstream signals may converge on Wrch1 directly through its SH3 domain-binding properties and interactions with effectors in multiprotein complexes, where PAK1, Grb2 and Nck can be considered as physiological binding partners of Wrch1.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät
Dokument erstellt am:	05.06.2013
Dateien geändert am:	05.06.2013
Promotionsantrag am:	12.03.2013
Datum der Promotion:	12.03.2013