Dokument: Characterization of HIV accessory protein interactions using NMR and microscale thermophoresis

Titel:	Characterization of HIV accessory protein interactions using NMR and microscale thermophoresis
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=25775
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20130523-094455-2
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Singh, Sameer Kumar [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 7,85 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 13.05.2013 / geändert 13.05.2013
Beitragende:	Prof. Dr. Willbold, Dieter [Gutachter] PD. Dr. König, Bernd [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Die akzessorischen Proteine von HIV-1 spielen eine wichtige Rolle für die Replikationseffizienz und Infektiosität des Virus. Zwei dieser Proteine, das Virusprotein U (VpU) und das Protein „negative factor“ (Nef), bewirken die Herunterregulierung des humanen CD4. VpU wird in der späten Phase des viralen Lebenszyklus gebildet und wirkt auf neu synthetisierte CD4-Moleküle im endoplasmatischen Retikulum. Die physische Bindung des VpU an CD4 stellt den ersten Schritt einer Ereigniskette dar, welche zum Abbau des CD4 über das Ubiquitin-Proteasom-System führt. Bisherige Studien haben gezeigt, dass bestimmte Bereiche in den zytoplasmatischen Regionen beider Proteine an der Bindung beteiligt sind. In der vorliegenden Arbeit wurde die kernmagnetische Resonanzspektroskopie (NMR) verwendet, um die CD4-VpU Wechselwirkung im Detail zu untersuchen. Teile von VpU und CD4, welche die für die CD4-VpU Bindung entscheidenden Regionen enthalten, wurden rekombinant im Milligramm-Maßstab in Escherichia coli hergestellt und lagen nach der Reinigung als homogene Produkte vor. Die Protein-Protein Wechselwirkung wurde mittels zweier komplementärer NMR Techniken untersucht, der Beeinflussung der chemischen Verschiebung infolge der Bindung („chemical shift perturbation“, CSP) und der Relaxationsverstärkung durch paramagnetische Sonden („paramagnetic relaxation enhancement“, PRE). Für die PRE-Experimente wurden drei Einzelcysteinvarianten des CD4 hergestellt und spezifisch mit der paramagnetischen Sonde MTSL markiert. Die CSP-Daten bestätigen die Beteiligung der beiden Helices 2 und 3 des VpU an der Bindung des CD4. Die PRE-Daten deuten darauf hin, dass die Bindung an VpU nicht ausschließlich über die bereits früher identifizierten Aminosäuren 414-419 (LSEKKT) des CD4 erfolgt, sondern ein größerer membrannaher Bereich der zytoplasmati¬schen Domäne des CD4 beteiligt ist. Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass sich die CSP- und PRE-Ergebnisse gegenseitig ergänzen und bestätigen. Die Dissoziationskonstante (Kd) der Wechselwirkung der untersuchten VpU- und CD4-Fragmente liegt im millimolaren Bereich. Im Mittelpunkt des zweiten Teils dieser Arbeit steht die Entwicklung und Anwendung eines Protokolls für die Charakterisierung der Wechselwirkungen von Membranproteinen mit Hilfe von Nanodisks und Thermophorese („microscale thermophoresis“, MST). Nanodisks sind besonders vorteilhafte Modellmembranen, welche bereits in verschiedenen Bereichen der Biophysik angewendet werden. MST ist eine relativ neue Methode zur Charakterisierung intermolekularer Wechselwirkungen, welche auf der differentiellen Bewegung von Proteinen und ihren Komplexen in einem Temperaturgradienten beruht. MST erfordert nur sehr geringe Proteinmengen, hat eine sehr hohe Empfindlichkeit und erlaubt die Untersuchung von Wechselwirkungen in Lösung. Protokolle für MST-basierte Untersuchungen wurden für zwei unterschiedliche Typen von Nanodisks entwickelt, welche entweder POPC oder DMPC als Lipid-Hauptkomponente enthalten. Das allgegenwärtige Problem der Adsorption von Nanodisks an die Wände der im MST-Experiment verwendeten Kapillaren konnte durch zwei verschiedene Maßnahmen umgangen werden. Entweder wurden der Nanodisk-Probe bestimmte Additive wie Detergenzien oder BSA zugesetzt oder die Nanodisk-Probe wurde durch eine Kernspurmembran gefiltert. Mit Hilfe des entwickelten Protokolls wurde die Wechselwirkung von Nef mit CD4 sowie die Interaktion zwischen den HIV-Proteinen Vpr und p6 untersucht, wobei jeweils ein Interaktionspartner in der Nanodisk verankert war. The accessory proteins from HIV-1 are now known to play vital roles in the replication efficiency and infectivity of the virus. Of these proteins, the virus protein U (VpU) and negative factor (Nef) are responsible for downregulation of human CD4. VpU is expressed late during the virus life cycle, and acts on newly synthesized CD4 molecules in the ER. Physical binding of VpU to CD4 triggers a pathway that leads to the degradation of CD4 via the ubiquitin-proteasomal system. Previous studies implicated certain regions in the cytoplasmic parts of both proteins in binding. In the present work nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy was used to study the CD4-VpU interaction in detail. Sections of VpU and CD4 containing regions crucial for CD4-VpU binding were recombinantly produced in Escherichia coli in milligram amounts and purified to homogeneity. The interaction was probed using two complementary NMR techniques, namely chemical shift perturbation (CSP), and paramagnetic relaxation enhancement (PRE) analyses. For the PRE experiments three different single cysteine CD4 variants were produced and specifically labelled with a paramagnetic probe, MTSL. The CSP data confirm involvement of helices 2 and 3 of VpU in CD4 binding. The PRE data indicate that binding to VpU doesn’t just involve the region 414-419 (LSEKKT) of CD4 as previously reported, but a larger membrane proximal part of the CD4 cytosolic domain as well. All in all, the CSP and PRE results corroborated each other. The dissociation constant (Kd) for the interaction of the studied VpU and CD4 fragments is found to be in the millimolar range. The second part of this work concerns the development and application of a protocol for characterization of membrane protein interactions using nanodiscs and microscale thermophoresis (MST). Nanodiscs are a superior model membrane, with reported applications in various areas of biophysics. Microscale thermophoresis is a relatively new method that characterizes intermolecular interactions based on the differential movement of proteins and their complexes in a thermal gradient. MST requires very little protein, is highly sensitive, and studies interactions in solution. Protocols for MST studies were developed for two different types of nanodiscs, containing either POPC or DMPC as the principal lipid. The persistent problem of adsorption of nanodiscs to the capillary walls used in MST was circumvented by either supplementing the nanodisc solutions with certain additives (detergents, BSA) or by filtering them through nuclepore membranes. The protocol was applied to the study of interactions between Nef and CD4 and between the HIV proteins Vpr and p6 with one interaction partner anchored in a nanodisc.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie
Dokument erstellt am:	23.05.2013
Dateien geändert am:	23.05.2013
Promotionsantrag am:	01.06.2012
Datum der Promotion:	26.06.2012