Dokument: Untersuchungen zu Struktur und Funktion von Polysacchariden und alterungsassoziierten Proteinmodifikationen bei Prionen

Titel:	Untersuchungen zu Struktur und Funktion von Polysacchariden und alterungsassoziierten Proteinmodifikationen bei Prionen
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=2574
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20030723-000574-1
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Dumpitak, Christian [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 14,27 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 09.02.2007 / geändert 09.02.2007
Beitragende:	Prof. Dr. Riesner, Detlev [Gutachter] Prof. Dr. Alfermann, August-Wilhelm [Gutachter]
Stichwörter:	Advanced Glycation Endproducts, Alterung, Corpora Amylacea, Glykogen, keiminduzierte Aggregation, Scaffold, Prion, Proteinaggregation, Protein-Polysaccharid-Wechselwirkung, V-Helixadvanced glycation endproducts, ageing, corpora amylacea, glycoanalysis, glycogen, seeded aggregation, prion, protein aggregation, protein polysaccharide interaction, V-helix
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Prionen sind Erreger fataler neurodegenerativer Erkrankungen bei Säugern. Sie bestehen haupt­sächlich aus einem wirtseigenen Protein, dem sog. Prionprotein (PrP). Dieses weist im Gegensatz zur zellulären Variante (PrPC) eine veränderte Konformation (PrPSc) auf und liegt in Form unlöslicher, proteolyseresistenter, neurotoxischer und infektiöser Aggregate vor. Um die pathogenen Eigenschaften von Prionen detaillierter verstehen zu können, ist es wichtig den Einfluss sekundärer Komponenten und direkter Umgebungsfaktoren auf die Bildung und Pathogenese von Prionen zu verstehen, insbesondere da in in-vitro-Experimenten bislang keine Infektiosität de novo erzeugt werden konnte. Eine solche Sekundärkomponente ist das Prion-Scaffold. Dieses inerte Polysaccharid-Gerüst macht 5-15 % von Prionrods aus und besteht hauptsächlich aus 1,4-verknüpfter Glucose mit wenigen 1,4,6-Verzweigungen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde mittels Komponenten- und Verknüpfungsanalysen gezeigt, dass das Prion-Scaffold kein Artefakt der Prionrod-Präparation ist, sondern eine generelle Komponente von Prionen. Nach Entwicklung einer Analysemethode für den µg- bis ng-Bereich wurde die Stereochemie der glykosidischen Bindungen des Prion-Scaffold als alpha-glyko­sidisch aufgeklärt. Durch Optimierung des Präparationsprotokolls wurde das Prion-Scaffold frei von Restinfektiosität präpariert, was eine Untersuchung des potentiellen Einflus­ses auf die Infektiosität von Prionen ermöglichte. Hierzu wurde ein in-vitro-Konversions­system adaptiert, in welchem PrP bei mittleren Natriumdodecylsulfat- (SDS-)konzentrationen löslich vorliegt und bei niedrigen SDS-Konzentrationen aggregiert. Nach erfolgreicher Adap­ta­tion und Unter­su­chung des Einflusses von Polysacchariden auf die in-vitro-Konversion von PrP wurde nachweisbar die Bildung von PrP/Polysaccharid-Koaggregaten induziert. Hierbei zeigte sich ferner, dass Glykogen als Modell für das Prion-Scaffold eine keiminduzierte PrP-Aggre­ga­tion vermittelte. Rekonsti­tutionsexperimente mit dem Prion-Scaffold und PrP er­brach­ten im Tiermodell bislang keinen Hinweis auf de novo erzeugte Infektiosität. In den noch bis März 2004 laufenden Studien wurden vorläufig Infektiositäten von mehr als 11-15 Id50/µg PrP ausgeschlossen. Ferner wurde das Vorkommen von Advanced Glycation Endproducts (AGEs) bei Prionen sowie deren potentieller Einfluss untersucht. AGEs sind alterungsassoziierte Modifikationen von Biomolekülen, die aus nicht-enzymatischen z.T. radikalischen Reak­tionen zwischen redu­zierenden Zuckern und z.B. freien Aminogruppen von Proteinen entstehen. AGEing von Proteinen führt oft zu Unlöslichkeit, proteolytischer Resistenz und Zytoto­xizität. Im Rahmen der durchgeführten Analysen wurden AGEs bei allen unter­suchten PrP-Präparaten gefunden. Dabei wies das infektionsassoziierte PrP 27-30 weniger AGEs auf, als PrPC aus gesunden Hamstern. Dies lässt vermuten, dass die Umwandlung von PrPC in PrPSc relativ früh nach der Translation erfolgt. Weitere Experimente, in denen PrP in vitro mit AGEs modifiziert wurde, zeigten AGE-vermittelte Unlöslichkeit von PrP bzw. eine Stabi­li­sie­rung von PrP-Aggregaten. Dies impliziert die Möglichkeit, dass AGE-modifizierte PrP-Aggregate als Keime für die PrP-Aggregation dienen können. Im Rahmen der Dis­kussion wurde ein Modell zur Entstehung von Glykogen/Protein-Koaggregaten wie dem Prion-Scaffold, aber auch anderer bekannter Koaggregate wie z.B. der Corpora amylacea, vorgestellt. Ferner wurde die mögliche Beteiligung von AGEs an den neurodegenerativen Prozessen bei Prionkrankheiten erörtert, und ein mögliches Zusammenspiel verschiedener molekularer Alterungs­mecha­nis­men bei neurodegenerativen Krankheiten diskutiert. Prions are infective agents of fatal neurodegenerative diseases in mammals. They are composed primarily of a host-protein, the so-called prion protein (PrP). In comparison to its cellular iso­form (PrPC) it shows changed conformation (PrPSc) and builds up insoluble as well as PK-resistant, neurotoxic and infective aggregates. To understand the pathological properties of prions in more detail, knowledge about the influence of secondary and micro-environmental com­po­nents onto prion-formation and ?pathogenesis is essential. This is especially important since in-vitro reconstitution of infectivity could not be shown by now. As secondary compo­nent an inert polysaccharide scaffold (prionscaffold) was found in prion rods (PrP 27-30) after intense PK-digestion amounting to 5-15% of PrP 27-30. It consisted of predominantly 1,4-linked glucose with few 1,4,6-branches. Within this thesis it could be shown by component- and linkage-analysis that the prionscaffold is a general component of prions and no artefact of prionrod preparation procedure. After deve­loping a method for µg-ng-scale stereochemistry analysis of glycosidic linkage, the prion­scaffold's linkage was shown to be alpha-glycosidic. By optimising the preparation protocol the prion­scaffold was prepared free of remaining infectivity, thus enabling reconstitution experi­ments. Therefore an in vitro transition system, in which PrP is soluble at medium Sodiumdode­cylsulfate (SDS) concentrations and aggregates at low SDS concentrations, was utilized. After determination of polysaccharidic influences onto in-vitro-conversion of PrP coaggregation of poly­saccharides and PrP could be induced provable. Furthermore it was shown that glycogen which was used as a model substance for the prionscaffold induced seeded PrP-aggregation. Reconstitution experiments with prion­scaffold and PrP gave no clinical sign of de novo infectivity in challenged animals by now. Since bioassays will be terminated in March 2004, infectivity titers of >10-15 ID50/µg PrP could be excluded preliminary. Furthermore the questions were addressed if advanced glycation endproducts (AGEs) are to be found in prions and what their potential influence might be. AGEs are modifications of bio molecules which are associated with ageing. They result from non-enzymatic partially radical re­actions of reducing sugars for example with amino groups of proteins. AGEs can be respon­sible for insolubility, proteolytic resistance and cytotoxicity of proteins. All analysed PrP-prepa­rations showed AGE-modifications. In comparison to non-infectious and cellular PrP-species PrP 27-30 had a lesser degree of AGE-content, showing that the conformational switch from PrPC to PrPSc must take place early after PrP-translation. In vitro AGEing of PrP lead to insolubility of PrP resp. stabilization of PrP-aggregates, suggesting that AGE-modified PrP-aggregates could be seeds for PrP-aggregation. A model for the formation of glycogen-protein coaggregates is introduced which could explain the origin of the prionscaffold as well as the formation of other well known co aggregates like corpora amylacea. Furthermore contributions of AGEs to the neuro­degenerative processes in prion diseases as well as the interplay of different molecular mechanisms of ageing in neurodegenerative diseases are discussed.
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Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie
Dokument erstellt am:	23.07.2003
Dateien geändert am:	12.02.2007
Promotionsantrag am:	18.07.2003
Datum der Promotion:	18.07.2003