Dokument: Molekulare Reaktionen des bdelloiden Rädertierchens Philodina roseola während der Trocknung

Titel:	Molekulare Reaktionen des bdelloiden Rädertierchens Philodina roseola während der Trocknung
Weiterer Titel:	Molecular responses of the bdelloid rotifer Philodina roseola to dehydration
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=25667
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20130430-083616-3
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Dr. Gombitang Nkwonkam, Marthe Christiane [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 973,2 KB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 29.04.2013 / geändert 29.04.2013
Beitragende:	Prof. Dr. D'Haese Jochen [Gutachter] Prof. Dr. Wagner, Rolf [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Anhydrobiose ist eine spezielle Form der Kryptobiose. Sie ermöglicht einem Organismus, extreme Austrocknung zu überleben, kann aber dennoch zu verschiedenen, irreversiblen Schäden führen, wie z.B. einer oxidativen Membrandegradation und Proteinaggregation. Viele Organismen haben Schutz- und Reparaturmechanismen entwickelt, um potentiell schädliche Folgen einer Austrocknung abzuschwächen oder sogar zu verhindern. Philodina roseola zählt zu den bdelloiden Rädertierchen und ist zur Anhydrobiose fähig, um wiederkehrende Trockenperioden in seinem Habitat zu überdauern. Zu diesem zählen Moose, die während ihres Lebenszyklus immer wieder beinahe vollständig austrocknen, so dass Radertierchen zu einer ständigen morphologischen und physiologischen Anpassung an ihre Umgebung gezwungen sind. Zu Beginn einer Anhydrobiose nehmen Rädertierchen die Gestalt eines Tönnchens an, wodurch ihre Körperoberfläche beträchtlich verkleinert wird. Bei einer relativen Luftfeuchtigkeit von 88 % benötigten sie dafür 6 - 10 h. Nach 24 h Trocknung bei gleicher relativer Luftfeuchtigkeit von 88 % überlebten fast alle Tiere. Demzufolge wurden diese Bedingungen für nachfolgende Experimente gewählt, da bereits eine längerfristiges Aussetzen (48 h bis 72 h) der Rädertierchen bei niedriger relativer Luftfeuchtigkeit (44 % bis 23 %) zu einer schlechteren Erholungsfähigkeit der Tiere führte (60 % bis 12 %). In einer Subtraktions-cDNA-Bibliothek von Philodina roseola, in der durch den Trocknungsprozess induzierte Transkripte angereichert waren, gelang die Identifizierung von late embryogenesis abundant, Superoxide Dismutase und Katalase cDNAs. Die Analyse der Transkriptionsrate der drei Gene mittels real time PCR in getrockneten Tieren zeigte eine vierzigfache Erhöhung für lea, eine siebenfache für sod und eine vierfache für cat gegenüber nicht getrockneten Kontrolltieren. Eine Unterdrückung der Expression von lea, sod und cat anhand von RNA-Interferenz sollte Aufschluss über eine mögliche essentielle Bedeutung dieser Proteine für das Überleben von Philodina roseola geben. Träger der RNA-Interferenz für lea, sod bzw. cat war der Vektor L4440, der in E. coli H115 transformiert wurde. Die verfütterten Bakterien wurden zu 80 % in Philodina-Kulturen gefressen, die jeweils entweder Leervektor, lea-dsRNA, cat-dsRNA bzw. sod-dsRNA aufgenommen haben. Im Gegensatz dazu wurden in Ansätzen mit dsRNA-sod/cat bzw. lea/sod/cat behandelten Rädertierchen nur 70 % der Bakterien gefressen. Die Behandlung der Rotatorien mit cat-, lea- und sod-dsRNA resultierte in einem erniedrigten Populationswachstum und sank auf 60 %, 76 % bzw. 59 % im Vergleich zur Kontrolle. Die Populationsgröße der Rotatorien nach Behandlung mit sod/cat- und lea/sod/cat-dsRNA fiel sogar auf 41 % bzw. 35 % im Vergleich zur Kontrolle. Die dsRNA-Behandlung führte in allen Fällen zu einer unterschiedlichen Runterregulation der Expression der drei Gene. In der vorliegenden Arbeit wurde zum ersten Mal die Expression von sod/cat bzw. lea/sod/cat gleichzeitig unterbunden. Der einzelne ‚knockdown‘ der drei Gene senkte die Expression um jeweils ca. 80 %. Auch die Überlebensrate von dsRNA-behandelten Rädertierchen nach Rehydrierung nahm deutlich ab und zwar auf 67 % (cat-dsRNA), 50 % (sod-dsRNA) bzw. 43 % (lea-dsRNA) während mit Leervektor behandelte Rotatorien zu 96 % überlebten. Der gleichzeitige ‚knockdown‘ von lea/sod/cat bzw. sod/cat senkte die Überlebensrate sogar auf nur 4 % bzw. 14 %. In dsRNA-unbehandelten Tieren führte die 24stündige Trocknung zu einem vierfachen Anstieg der intrazellulären Menge an reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) im Vergleich zu Tieren in feuchter Umgebung. In sod- und cat-dsRNA behandelten Rädertierchen wurde eine zwölffach höhere ROS-Konzentration gemessen und in dsRNA-lea/sod/cat bzw. dsRNA-sod/cat behandelten Rädertierchen stieg die ROS-Menge sogar um das 28-fache. Der ‚knockdown‘ der lea-Expression zeigt überraschend keinen Einfluß auf die ROS-Menge. Die 24stündige Trocknung hat auch Auswirkungen auf die DNA-Integrität. In dsRNA-unbehandelten Tieren sowie mit Leervektor behandelten Tiere zeigte sich jeweils eine vierfache Zunahme der DNA-Schäden im Vergleich zu Tieren in feuchter Umgebung. Behandlung mit jeweils sod-dsRNA, lea-dsRNA bzw. cat-dsRNA führte zu einer 20-fachen ROS-Erhöhung nach Trocknung. Die vorliegende Arbeit zeigt zum ersten Mal, dass die Überexpression der Proteine SOD und Katalase während des Trocknungsprozesses von Rotatorien einen sehr bedeutungsvollen schützenden Effekt im Hinblick auf ROS- und DNA-Schäden bewirkt. LEA verhindert offenbar ebenfalls DNA-Schäden während der Trocknung, was zuvor noch nicht nachgewiesen wurde. Anhydrobiosis is a special form of cryptobiosis, which enables various organisms to tolerate desiccation. In this state, however, they may suffer various and sometimes irreversible damages such as membrane peroxidation and protein aggregation. To weaken or even prevent harmful consequences of desiccation protective and repair mechanisms have been developed. The bdelloid rotifer Philodina roseola is able to survive phases of dryness, which occur in its habitat, i.e. mosses that dry up more or less periodically. Hence, rotifers permanently adapt morphologically and physiologically to their current environment. Entering anhydrobiosis rotifers reduce their body surface and form a tun. After 6 h to 10 h and at a relative humidity of 88 % the rotifers contracted into a tun. After exposition of Philodina roseola to a relative humidity of 88 % for 24 h approx. 100 % of the specimen survived. Therefore these conditions were used for further experiments as longer desiccation periods (48 h to 72 h) and a lower relative humidity (44 % to 23 %) reduced the capacity of Philodina roseola to recover (60 % to 12 %). In a cDNA subtractive library of Philodina roseola in which desiccation induced transcipts were enriched cDNAs of lea, sod and late embryogenesis abundant, superoxide dismutase and catalase have been successfully identified. The analysis of the rate of transcription of these genes was determined by real time PCR and showed a fourty fold overexpression of lea, and seven fold overexpression of sod and a four fold overexpression of cat compared to the non desiccated control rotifers. To examine the possible essential significance of the proteins LEA, SOD and catalase for the survival of Philodina roseola, the suppression of these genes via RNA interference was carried out experimentally. The vector L4440 was used as carrier for the RNA intereference and was transformed into E. coli H115. 80 % of the bacteria harbouring the empty L4440-vector, lea-, cat- and sod-dsRNA respectively were ingested by Philodina roseola and only 70 % of bacteria treated with sod/cat- and lea/sod/cat-dsRNA respectively were ingested.This treatment with dsRNA led to a down regulation of the expression of the genes lea, cat and sod in all of the combinations mentioned above. In the present work sod/cat and lea/sod/cat respectively were knocked down simultaneously for the first time. The expression of the single genes was reduced by approx. 80 %. Treatment of rotifers with cat-, lea- and sod-dsRNA resulted in a decrease of population of 60 %, 76 % and 59 % respectively compared with control. The reproduction rate of rotifers was considerably decreased of 41 % and 35 % respectively after treatment with sod/cat- and lea/sod/cat-dsRNA. The recovery rate after desiccation considerably decreased to 67 % (cat-dsRNA), 50 % (sod-dsRNA) and to 43 % (lea-dsRNA) respectively, whereas 96 % of empty treated rotifers survived. The simultaneous knockdown of sod/cat and lea/sod/cat reduced the recovery rate even more to 4 % (lea/sod/cat) and 14 % (sod/cat) respectively. An Exposure to desiccation for 24 h resulted in a 4 fold increase of the ROS level in non dsRNA treated rotifers in comparison to control rotifers in a humid environment. After sod-dsRNA and cat-dsRNA treatment a 12 fold increase of ROS was observed, whereas a simultaneous treatment with sod/cat and lea/sod/cat resulted in a 28 times higher ROS level. Surprisingly the knockdown of lea showed no effect on the ROS concentration. A desiccation for 24 h also has shown to have impact on DNA integrity. In dsRNA untreated rotifers as well as in rotifers harbouring an empty vector the amount of DNA-lesions increased about 4 times compared to rotifers under humid conditions. After knockdown of the single genes the rate of DNA-lesions arose about 20 times. The present study shows for the first time a protective effect of SOD and catalase by reducing the ROS level and DNA damages. LEA was shown as not previously described to prevent DNA damage during desiccation.
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Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » Zoomorphologie, Zellbiologie und Parasitologie
Dokument erstellt am:	30.04.2013
Dateien geändert am:	30.04.2013
Promotionsantrag am:	01.06.2012
Datum der Promotion:	18.01.2013