Dokument: Screening und Charakterisierung neuer Aminosäure-Amidasen zur Racematspaltung
Klonierung und Expression einer D-Amidase aus Variovorax paradoxus in E. coli

Titel:Screening und Charakterisierung neuer Aminosäure-Amidasen zur Racematspaltung
Klonierung und Expression einer D-Amidase aus Variovorax paradoxus in E. coli
URL für Lesezeichen:https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=2528
URN (NBN):urn:nbn:de:hbz:061-20030609-000528-2
Kollektion:Dissertationen
Sprache:Deutsch
Dokumententyp:Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:Text
Autor: Krieg, Lutz [Autor]
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Dateien vom 09.02.2007 / geändert 09.02.2007
Beitragende:Prof. Dr. Kula, Maria-Regina [Gutachter]
Prof. Dr. Weiss, Hanns [Gutachter]
Stichwörter:Screening, D-Amidase, L-Amidase, tert-Leucin, Variovorax paradoxus, Rhizobium huautlense, Racematspaltung, Klonierung, ExpressionScreening, D-amidase, L-amidase, tert-leucine, Variovorax paradoxus, Rhizobium huautlense, Kinetic Resolution, Cloning, Expression
Dewey Dezimal-Klassifikation:500 Naturwissenschaften und Mathematik » 540 Chemie
Beschreibungen:Zur Gewinnung von D-tertiär-Leucin (D-Tle) wurde in einem Screening-Verfahren mit Proben natürlicher Standorte nach neuen mikrobiellen Aminosäure-Amidasen gesucht. Als die am besten geeignetsten Isolate wurden Variovorax paradoxus mit einer D-Amidase- und Rhizobium huautlense mit einer L-Amidase-Aktivität ausgewählt.
Die D-Amidase aus V. paradoxus wurde in drei Chromatographieschritten bis zur Homogenität aufgereinigt und vollständig charakterisiert. Das Enzym hydrolysiert neben einer Vielzahl von Aminosäureamiden auch Amide von Carbonsäuren und 2-Hydroxycarbonsäuren. Die Racematspaltung mit DL-tertiär-Leucinamid (DL-Tle-NH2) ergab eine spezifische Aktivität von 1,4 U/mg und Enantioselektivitäten für D-Tle größer 99% ee bei Umsätzen von mehr als 47%, woraus sich ein E-Wert größer als 200 berechnet.
Die Sequenzbestimmung des N-Terminus sowie die hieraus abgeleitete Homologie zu Enzymen der \\\\\\\"Amidase Signature\\\\\\\"-Familie ermöglichte die Identifizierung der entsprechenden Gensequenz. Deren Klonierung ermöglichte die heterologe Expression der D-Amidase in E. coli, in dessen Rohextrakt sie im Vergleich zur Expression im Wildtyp-Stamm eine mindestens 4-fach höhere spez. Akt. aufwies.
Für die L-Amidase aus R. huautlense wurde bereits im Rohextrakt eine Metallionen-Abhängigkeit, insbesondere für Zn, sowie eine ungewöhnlich hohe Temperaturabhängigkeit und Stabilität festgestellt. Das bis dahin partiell aufgereinigte Enzym wies eine spez. Akt. von 42 U/mg für DL-Tle-NH2 auf. Die Untersuchung des Temperaturoptimums im Bereich von 20 bis 95°C ergab eine Steigerung der Aktivität um das fast 20-fache und ein Optimum größer als 90°C. Weiterhin zeigte die L-Amidase ein vielseitiges Substratspektrum, wobei das Enzym bei racemischen Substraten nahezu ausschließlich die Hydrolyse des L-Enantiomers katalysierte.

For the production of D-tert-leucine (D-Tle) a screening was performed with samples of natural habitats to search for new bacterial amino acid amidases. As the most suitable isolates Variovorax paradoxus and Rhizobium huautlense with a D-amidase and a L-amidase activity, respectively, were selected.
The D-amidase from V. paradoxus was purified to homogeneity by three chromatographic steps and completely characterized. The enzyme hydrolyzes a large number of amino acid amides as well as carboxylic amides and 2-hydroxy acid amides. The kinetic resolution of DL-tert-leucine amide (DL-Tle-NH2) exhibits a specific activity of 1,4 U/mg and enantioselectivity for D-Tle with an ee higher than 99% at conversions of up to 47%. Therefore, the enantiomeric ratio E was calculated to be higher than 200.
The determination of the N-terminal amino acid sequence and its homology with enzymes of the so called amidase signature family yielded in the identification of the gene sequence. Subsequent to its cloning, the heterologous expression of D-amidase in E. coli resulted in the determination of an at least fourfold higher specific activity in the crude extract compared to D-amidase expressed in wild-type cells.
For the L-amidase from R. huautlense a reliance on metal ions, especially for Zn, was observed even in the crude extract. Likewise an unusual high temperature dependency and stability was determined. The so far partially purified enzyme showed a specific activity of 42 U/mg for the substrate DL-Tle-NH2. Investigation of the temperature optimum in the range of 20 to 95°C showed an almost twentyfold increase in the enzymatic activity and an optimum above 90°C. Furthermore, the L-amidase revealed a very broad substrate specificity and in the case of racemic amino acid amides the enzyme hydrolyzed almost exclusively the L-enantiomer.
Fachbereich / Einrichtung:Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Chemie
Dokument erstellt am:09.06.2003
Dateien geändert am:12.02.2007
Promotionsantrag am:08.07.2002
Datum der Promotion:08.07.2002
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