Dokument: Funktionelle Koexpression geclusterter Gene in verschiedenen Bakterien mithilfe des TREX-Systems
| Titel: | Funktionelle Koexpression geclusterter Gene in verschiedenen Bakterien mithilfe des TREX-Systems | |||||||
| Weiterer Titel: | Functional coexpression of clustered genes in different bacteria using the TREX system | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=24577 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20130503-132004-2 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Deutsch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Loeschcke, Anita [Autor] | |||||||
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| Stichwörter: | Mikroorganismen, Sekundärmetabolite, Gencluster, heterologe Expression, T7 RNA Polymerase | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie | |||||||
| Beschreibungen: | Eine Vielzahl biotechnologisch oder medizinisch bedeutsamer Stoffe wird von Mikroorganismen produziert. Da die Extraktion dieser Naturstoffe aus ihren natürlichen Produzenten nur eingeschränkt möglich ist, werden die Verbindungen häufig in heterologen Wirtsstämmen produziert. Dafür müssen ganze Biosynthese-Gencluster in solchen Wirten exprimiert werden. Bei der Aktivierung eines fremden Biosynthese-Genclusters in einem heterologen Wirt ist die Kompatibilität des kodierten Biosyntheseweges mit der Wirtsphysiologie schwer vorherzusagen. Daher ist ein breites Screening verschiedener Wirtsorganismen wünschenswert. Dies ist allerdings bislang mit einigem Aufwand verbunden, weil für die heterologe Expression eines Genclusters in verschiedenen Wirtskandidaten üblicherweise verschiedene genetische Elemente für jeden Wirt spezifisch angepasst werden müssen.
Das TREX-System ist ein neues Expressions-tool, das durch ein kombinatorisches Verfahren die heterologe Expression isolierter, unmanipulierter Gencluster in verschiedenen bakteriellen Wirten ermöglichen soll. Es besteht aus zwei Genkassetten, die alle genetischen Elemente enthalten, um die folgenden vier Schritte zu ermöglichen: (i) Zunächst wird ein Vektor-getragenes Gencluster mit den TREX-Kassetten markiert. (ii) Danach wird das gesamte Konstrukt mittels Konjugation in einen Expressionswirt eingebracht und (iii) durch Transposition im bakteriellen Chromosom inseriert, wo es (iv) schließlich von beiden Seiten aus durch die T7 RNA Polymerase exprimiert wird. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde die TREX-Anwendung eingehend charakterisiert. Dabei standen zwei Hauptfragen im Vordergrund: Es wurde (i) die Umsetzbarkeit der im TREX-System vorgesehenen simultanen, konvergenten Transkription eines Genclusters durch die T7 RNA Polymerase untersucht und (ii) die Anwendbarkeit des Systems in einem weiten Wirtsspektrum überprüft. Dazu wurde das Carotinoidbiosynthese-Gencluster (crt) aus P. ananatis mittels TREX in P. putida, R. capsulatus und E. coli zur Expression gebracht. Zunächst wurde unter Verwendung von P. putida als Wirt die Anwendbarkeit des konzertiert-bidirektionalen Transkriptionsmodus des TREX-Systems demonstriert, indem über die volle Länge des Genclusters Transkripte in beiden Orientierungen mittels RT-qPCR nachgewiesen werden konnten. Die Funktionalität sämtlicher Genprodukte konnte außerdem durch HPLC-Analyse der gebildeten Carotinoide nachgewiesen werden. Weiterhin wurde das intrinsisch carotinogene Bakterium R. capsulatus als Produktionswirt verwendet. Durch die Kombination von Manipulation der intrinsischen Carotinoid-Biosynthese von R. capsulatus und TREX-vermittelter Expression heterologer crt-Gene konnte der P. ananatis-spezifische Carotinoid-Biosyntheseweg erfolgreich in diesem Wirt etabliert werden. Schließlich wurde die TREX-vermittelte Carotinoid-Produktion im Standard-Expressionswirt E. coli demonstriert. Zusammenfassend konnte die Umsetzbarkeit aller Schritte der TREX-Anwendung in allen verwendeten Wirten bestätigt werden. Damit wurde gezeigt, dass das TREX-System die Expression unmanipulierter Gencluster in verschiedenen bakteriellen Wirten ermöglicht und so den Zugang zu wertvollen mikrobiellen Naturstoffen verbessert.A large number of substances with biotechnological or medical potential is produced by micoorganisms. Since the direct acces to these natural substances by extraction from the original producers is limited, these compounds are often synthesized in heterologous hosts. For heterologous biosynthesis, whole biosynthetic gene clusters have to be expressed in such hosts. In the activation of a foreign biosynthetic gene cluster in a heterologous host, the compatibility of the encoded biosynthetic pathway with the host’s physiology is difficult to predict. Therefore, a broad screening approach in different host organisms is favorable. However, this momentarily means time-consuming adaption of certain genetic elements for the heterologous expression of gene clusters in individual host candidates. The TREX system is a novel expression tool which is designed to allow the expression of unmanipulated gene clusters in various bacterial hosts by applying a combinatorial approach. It consists of two gene cassettes that contain all genetic elements to enable the following four steps: (i) A vector-borne gene cluster is labeled with the two TREX cassettes. (ii) The produced construct is then mobilized to an expression host by conjugation and (iii) integrated into the bacterial host chromosome by transposition, where (iv) it is transcribed from both sides by T7 RNA polymerase. Within the presented work, the TREX systems’ realization was characterized in detail, while two main questions were addressed: (i) The feasibility of the simultaneous bidirectional expression of a gene cluster by the T7 RNA polymerase and (ii) the applicability of the system in a broad host range. To this end, the carotenoid biosynthesis gene cluster (crt) from P. ananatis was expressed in P. putida, R. capsulatus and E. coli using TREX. Using P. putida as expression host, the feasibility of the TREX systems’ concerted bidirectional expression mode was demonstrated by applying RT-qPCR for detection of crt transcripts in both orientations over the complete gene cluster. Functionality of the gene products was shown by HPLC analysis of produced carotenoids. Furthermore, the intrinsically carotenogenic bacterium R. capsulatus was used as another production host. Applying a combination of metabolic engineering of the intrinsic carotenoid biosynthesis of R. capsulatus and TREX-mediated expression of heterologous crt genes, the P. ananatis-specific carotenoid biosynthesis could be established successfully in this host. Finally, TREX-mediated carotenoid production was also demonstrated with standard expression host E. coli. In summary, robust functionality of the TREX system was verified in all tested hosts. In conclusion, the TREX system allows the expression of unmanipulated gene clusters in various bacterial hosts thereby improving accessibility of valuable microbial natural substances. | |||||||
| Lizenz: |  Urheberrechtsschutz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » Mikrobiologie | |||||||
| Dokument erstellt am: | 03.05.2013 | |||||||
| Dateien geändert am: | 03.05.2013 | |||||||
| Datum der Promotion: | 24.10.2012 |
