Dokument: Whole-embryo culture of mouse embryos to study vascular development
| Titel: | Whole-embryo culture of mouse embryos to study vascular development | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=24576 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20130412-162917-0 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Deutsch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Zeeb, Martin [Autor] | |||||||
| Dateien: |
| |||||||
| Beitragende: | Prof. Dr. Lammert, Eckhard [Betreuer/Doktorvater] Prof. Dr. Bridges, Christopher R. [Gutachter] | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie | |||||||
| Beschreibungen: | Entstehung funktioneller Blutgefäße ist eine Grundvoraussetzung für das Überleben aller höherer Organismen, da Blutzirkulation für den Transport von Nährstoffen, Atemgasen und Stoffwechselsignalen zu den Geweben, so wie für den Abtransport von Abfallstoffen und Kohlendioxid unentbehrlich ist. Blutgefäße sind außerdem in die Entstehung von Krankheiten wie Krebs und
Schlaganfall verwickelt. Deshalb ist es von essentieller Bedeutung, die Entstehung der Blutgefäße zu verstehen und zu manipulieren, um neue Ziele für therapeutische Maßnahmen zu finden. Die zwei wichtigsten Formen der Gefäßentstehung, Vasculogenese und Angiogenese, beinhalten beide die Polarisierung von Endothelzellen, vor der eigentlichen Lumenbildung. Bis vor kurzem dachte man, dass die Verschmelzung intrazellulärer Vakuolen der wichtigste Mechanismus der Lumenbildung sei. Nun jedoch, richtet sich die Aufmerksamkeit mehr auf die extrazelluläre Lumenbildung. Der Umbau vaskulärer Verknüpfungspunkte, das Entstehen einer apikalen Membran, so wie die Trennung gegenüberliegender Endothelzellmembranen sind entscheidende Schritte dieses Prozesses. Die Aufklärung der zu Grunde liegenden Mechanismen und Moleküle erfordert eine präzise und reproduzierbare Technik zur Manipulation und Darstellung. Bisherige Studien wurden zumeist in Embryonen der Fischgattung Danio rerio durchgeführt, da diese billig, leicht zu handhaben und zu manipulieren sind, da sie in der Embryonalentwicklung transparent sind. Zebrabärblinge (Danio rerio) zeigen jedoch auffällige Unterschiede zu Mäusen und Menschen bei der Herzentstehung, der Sprossung der intersomitischen Gefäße, der Bildung der Aorta, sowie dem Ort der Blutbildung. Deshalb sind Studien der embryonalen Mausentwicklung auf molekularer Ebene dringend notwendig und hervorragend geeignet um Studien am Zebrabärbling zu ergänzen. Um die Anforderungen zu erfüllen, die an diese neuen Studien der Blutgefäßentwicklung in der Maus gestellt werden, habe ich die Methode der ex vivo-Kultivierung ganzer Mausembryonen verbessert. Mausembryonen können jetzt nach Manipulation der Gefäßentwicklung für bis zu 24 Stunden weiter kultiviert werden. Nach der Kultur können sie im Ganzen oder in Schnitten gefärbt oder mit anderen Methoden untersucht werden. Die Manipulation erreicht man durch die Injektion pharmakologischer Substanzen oder Antikörper, die spezifisch Signalwege blockieren oder aktivieren. Diese Behandlung erfordert nur kleinste Mengen an Substanz und grenzt die Effekte lokal, auf die Injektionsregion, ein, wodurch interne Kontrollen verwendet werden können. Die neu entwickelten Medien zur Kultur kommen gänzlich ohne oder nur mit Kälberserum aus, so dass der Preis der Kultur um bis zu 90% sinkt und primäre Antikörper jeder verbreiteten Spezies verwendet werden können. Unter Anwendung dieser Technik können Vasculogenese und Angiogenese jetzt im vollständigen Mausembryo mittels Konfokalmikroskopie untersucht werden. Zusätzlich zur Gefäßentwicklung können beliebige weitere Entwicklungsprozesse, die im selben Zeitrahmen ablaufen, untersucht werden. Wir haben frühe Versionen dieser Technik dazu verwendet, um den Einfluss der negativ geladenen Sialomucine, insbesondere von Podocalyxin, auf die Lumenbildung zu untersuchen. Wir konnten zeigen, dass die Sialinsäurereste, bzw. ihre negativen Ladungen notwendig und entscheidend für die Bildung des ersten Spalts zwischen zwei aneinander liegenden Endothelzellen sind. Das Entfernen oder Verdecken der negative Ladungen hatte einen Rückgang der Lumenbildung zur Folge, ein Effekt der durch die künstliche Zugabe von negativen Ladungen verhindert werden konnte. Die Bildung eines Spalts zwischen Endothelzellen, die durch negative Ladungen hervorgerufen wird, wurde dabei nach der Polarisierung als initialer Schritt in der Lumenbildung der Aorta identifiziert.Formation of functional blood vessels is a prerequisite for all higher organisms, as blood circulation is required for the delivery of nutrients, oxygen and metabolic signals to tissues, as well as the removal of waste products and carbon dioxide. Blood vessels are also implicated in many diseases such as cancer, stroke or diabetic retinopathy. It is therefore of vital importance to understand and potentially manipulate blood vessel development in mammalian systems in order to find suitable targets for therapeutic treatments. Both major modes of blood vessel formation, vasculogenesis and angiogenesis, require polarization of endothelial cells prior to lumenization. Up until recently, intracellular vacuole coalescence was thought to be the most important mechanism of lumen formation, whereas now, the focus has shifted towards extracellular lumen formation. Remodeling of vascular junctions, emergence of an apical membrane, and separation of apposing endothelial cell membranes are critical steps during this process. As the functional mechanisms and molecules underlying these processes become unraveled, an accurate and high-quality technique of manipulation and imaging is required to advance our knowledge. Previous vessel formation studies have mostly been conducted in zebrafish (Danio rerio) embryos, as they are cheap, easy to handle and to manipulate, and transparent during development. However, zebrafish embryos show striking differences to mammals such as mouse or humans concerning heart morphogenesis, intersomitic vessel sprouting, dorsal aorta formation, and the site of hematopoiesis. Therefore, molecular investigations of mouse embryonic vessel development are necessary and nicely complement zebrafish studies. In order to meet the requirements of blood vessel development studies in the mouse, I have refined and improved the method for whole-embryo ex vivo culture of mouse embryos. Now, mouse embryos can be isolated from the maternal uterus, vessel formation can be manipulated, and embryos can subsequently be cultured for up to 24 hours. After culture, mouse embryos can be subjected to whole-embryo staining, immuno-histochemistry, in situ hybridization or cell sorting. Manipulation of mouse embryos can be achieved by local injection of pharmacological compounds or antibodies to block or activate specific signaling pathways. This treatment requires minimal amounts of substance, locally restricts its effects, and allows using internal controls. The new culture media are free of serum or only contain calf serum, thus reducing the price of culture by up to 90% and allowing the use of primary antibodies from all common species. Following this technique, vasculogenesis and angiogenesis can be analyzed in a complete mouse embryo with simple confocal microscopy. Additionally, other developmental processes can be analyzed as required by the researcher. We have used this technique to investigate the influence of negatively charged sialomucins, namely Podocalyxin (PODXL), on the process of lumen formation. We could show that sialic acids and, more specifically, their negative charges are necessary for slit formation between apposing endothelial cells during aortic lumen formation. Removal or masking of negative charges suppressed lumen formation, an effect that could be rescued by addition of artificial negative charges. Slit-formation, driven by negative charges on sialomucins was thereby identified as the initial step of vascular lumen formation in the mouse dorsal aorta following its polarization. | |||||||
| Lizenz: |  Urheberrechtsschutz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » Zoophysiologie | |||||||
| Dokument erstellt am: | 12.04.2013 | |||||||
| Dateien geändert am: | 12.04.2013 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 21.11.2012 | |||||||
| Datum der Promotion: | 05.03.2013 |
