Dokument: Funktionelle Charakterisierung und Therapie von humanen pathogenen Spleißmutationen

Titel:	Funktionelle Charakterisierung und Therapie von humanen pathogenen Spleißmutationen
Weiterer Titel:	Functional characterization and therapy of human pathogenic splicing mutations
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=24307
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20130411-181135-1
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Dr. Hartmann, Linda [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 3,49 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 25.03.2013 / geändert 25.03.2013
Beitragende:	Prof. Dr. Schaal, Heiner [Betreuer/Doktorvater] Prof. Dr. Wagner, Rolf [Gutachter]
Stichwörter:	splicing, mutation, gene therapy
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Humane Genmutationen, die ein präzises Spleißen der prä-mRNA verhindern, werden zunehmend als ein wichtiger krankheitsauslösender Mechanismus anerkannt. Die akkurate Erkennung von kodierenden Exon-Sequenzen ist eine Grundvoraussetzung für die Generierung von intakten und funktionsfähigen Proteinen. Auch wenn computergestützte Analysen die Wahrscheinlichkeit für ein fehlerhaftes Spleißen mit beachtlichem Erfolg vorhersagen können, erfordert eine vertrauenswürdige Diagnose des Spleiß-Phänotyps immer noch funktionelle Spleiß-Assays. In der vorliegenden Arbeit wurde ein auf einem Spleiß-Reporter Minigen basierender funktionaler Spleiß-Assay genutzt, um die Voraussetzungen für die Exon-Erkennung in einem heterologen Kontext zu ermitteln. Es zeigte sich, dass die Erkennung der humanen ATM Exons 9 und 54 nicht nur von jeweiligen Exon-Sequenz und den flankierenden Spleißstellen sondern auch von der Stärke der Spleißstellen im Spleiß-Reporter Konstrukt abhängig war. Hierbei kann die natürliche Intron-Sequenz unmittelbar stromabwärts von der Spleißdonor-Stelle einen ausschlaggebenden Einfluss auf die Exon-Erkennung im Minigenkonstrukt haben. Es wurde bestätigt, dass zwei putativ pathogene Spleißdonor Mutationen im RAD51C Gen den Verlust der Exon-Erkennung oder die Aktivierung von kryptischen Spleißstellen verursachen, wodurch diese eindeutig mit einem erhöhten Risiko für ein Mamma- oder Ovarkarzinom assoziiert werden konnten. Mittels RNA-Affinitätschromatographie und Massenspektrometrie wurde nachgewiesen, dass die spleißregulatorischen Proteine hnRNP H1, A1 und M4 an die wildtypische Sequenz von BRCA2 Exon 6 binden, jedoch nicht, wenn eine bei an Fanconi Anämie erkrankten Patienten gefundene Mikro-Deletion in diesem Exon vorliegt. Dieser Befund stand im Einklang einer Veränderung des BRCA2 Spleißmusters durch die Mikro-Deletion. Weiterhin wurde der Mechanismus der Aktivierung von kryptischen Spleißstellen am Beispiel einer in FGB Exon 7 beschriebenen +1G>T Spleißdonor-Mutation untersucht. Die Ergebnisse ließen die Schlußfolgerung zu, dass die die lokale Dichte an spleißfördernden Enhancer-Elementen und auch die Spleißdonor-Stärke entscheidend dafür sein könnte, ob eine Spleißdonor-Mutation zum Verlust der Exon-Erkennung oder zur Aktivierung von kryptischen Spleißstellen führt. Da die am häufigsten vorkommende Mutation in humanen Spleißdonor-Stellen bei erblich bedingten Erkrankungen das Guanosin-Nukleotid innerhalb des hochkonservierten GT-Dinukleotides betrifft, wurde eine in FANCC Exon 2 gefundene +1G>T Spleißdonor-Mutation auf ihre Pathogenität untersucht. Obwohl bisher angenommen wurde, dass jeder Basenaustausch an dieser Position eine normale mRNA-Prozessierung vollständig verhindert, zeigten die Ergebnisse dieser Arbeit unerwarteterweise, dass die Spleißdonor-Stelle trotz der +1G>T Mutation mit stark reduzierter Effizienz in primären Fibroblasten von an Fanconi Anämie erkrankten Patienten genutzt wurde. Die systematische Mutation und vergleichende Analyse der FGB Exon 7 und FANCC Exon 2 +1G>T Spleißdonor-Stelle in Minigenkonstrukten machte deutlich, dass sowohl das nicht-kanonische TT-Dinukleotid als auch der genomische Kontext von FANCC für das Spleißen an der mutanten Spleißdonor-Stelle erforderlich waren. Die lentiviral vermittelte stabile Expression von an die patogene FANCC TT Spleißdonor-Stelle adaptierten U1 snRNA Molekülen verbesserte spezifisch die Erkennung von FANCC Exon 2 und konnte die normale Mono-Ubiquitinierung des FANCD2 Proteins wiederherstellen. Darüber hinaus komplementierte der lentivirale Transfer der TT-adaptierten U1 snRNA Moleküle den für Zellen von Fanconi Anämie Patienten typischen G2-Zellzyklusarrest nach Stimulation mit DNA-schädigen Substanzen. Damit wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit erstmalig ein neuer RNA-basierter Gentherapieansatz für die Therapie von Spleißmutationen aufgezeigt. Human gene mutations interfering with precise precursor messenger RNA (mRNA) splicing are increasingly recognized as an important mechanism through which gene mutations cause human disease, since accurate exon recognition is a mandatory prerequisite for generation of intact and functional proteins. Although in silico tools predict the probability for aberrant splicing with considerable success reliable diagnosis of the splicing phenotype of a splice site mutation still requires functional splicing assays due to the complex interplay of splice site-defining sequence elements. In this thesis a functional splicing assay based on a splicing reporter minigene construct was used to assess the requirements for exon recognition in a heterologous context. The results of this thesis showed that recognition of human ATM exon 9 and 54 was not only dependent on the exon sequence and the strength of its flanking splice sites but also on the strength of the splice sites of the splicing reporter construct. It was demonstrated that the natural intron sequence immediately downstream of the splice donor site of both exons can have a crucial influence on exon recognition in the minigene construct. Using the splicing reporter minigene it was validated that that two putative pathogenic splice donor mutations found in the RAD51C gene cause loss of exon recognition or activation of cryptic splice donor sites and therefore were clearly associated with an elevated risk of breast and ovarian cancer. Likewise it was shown that a patient-derived homozygous micro-deletion within BRCA2 exon 6 interfered with splicing pattern of the BRCA2 transcript. RNA affinity chromatography visualized three cellular proteins bound only to the wild type BRCA2 exon 6 but not to the mutant one, which were subsequently identified by mass spectrometry to be the heterogenous ribonucleoproteins (hnRNPs) H1, A1 and M4, which were previously shown to be involved in the regulation of splicing. Further the mechanism of cryptic splice donor activation was investigated exemplified by a +1G>T splice donor mutation described in FGB exon 7 suggesting that the local density of splicing enhancer elements and splice donor strength might be decisive whether a splice donor mutation results in skipping of the affected exon or in activation of cryptic splice sites. Since the most frequent base-pair mutation in human splice donor sites in inherited diseases comprises the guanosine within the highly conserved GT dinucleotide, a +1G>T splice donor mutation found in FANCC exon 2 was investigated for its pathogenicity within the context of this thesis. Although any base-pair substitution at this position was thought to completely abrogated normal mRNA processing the results of this thesis demonstrated in primary fibroblasts from Fanconi anemia patients that the mutation unexpectedly allowed correct splicing, albeit with decreased efficieny. Systematic mutation and comparative analysis of the FGB exon 7 and the FANCC exon 2 +1G>T splice donor within minigene constructs revealed that both the noncanonical TT dinucleotide and the genomic context of FANCC were required for the residual correct splicing at the mutant splice donor. Lentivirus-mediated expression of U1 snRNA molecules adapted to the mutant TT splice donor site specifically improved FANCC exon 2 inclusion and restored normal FANCD2-monoubiquitination in the patient-derived fibroblasts. Finally, lentiviral expression of the TT adapted U1 snRNA molecules corrected the DNA damage-induced G2 cell cycle arrest of primary patient derived fibroblasts. These data indicated that stably lentivirus-mediated expression of the TT-adapted U1 snRNA molecules can lead to the production of sufficient amounts of endogenous functional FANCC transcript for correction of the cellular phenotype of the disease, thus opening an alternative transcript-targeting approach for gene therapy of inherited splice site mutations.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie
Dokument erstellt am:	11.04.2013
Dateien geändert am:	11.04.2013
Promotionsantrag am:	27.04.2012
Datum der Promotion:	30.05.2012