Dokument: Analyse der GSK3β-abhängigen Signaltransduktion durch Identifizierung assoziierter Proteinkomplexe

Titel:	Analyse der GSK3β-abhängigen Signaltransduktion durch Identifizierung assoziierter Proteinkomplexe
Weiterer Titel:	Analysis of GSK3β dependent signal transduction via identification of associated protein complexes
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=23640
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20130130-135810-6
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Hamer, Sabine [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 6,19 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 30.01.2013 / geändert 30.01.2013
Beitragende:	Prof. Dr. Gödecke, Axel [Gutachter] Prof. Dr. Klein, Thomas [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Glykogen Synthase Kinase 3 beta (GSK3β) ist eine Proteinkinase, die eine Vielzahl zellulärer Funktionen reguliert. So spielt sie z.B. eine essentielle Rolle bei der Regulation des Stoffwechsels, des Wachstums und der Differenzierung. Über eine Serin 9-Phosphorylierung (z.B. durch AKT, PKC) wird die konstitutiv aktive GSK3β inaktiviert, wohingegen ihre Aktivität über eine Tyr216-Phosphorylierung gesteigert wird. In der aktiven Form besitzt GSK3β eine besondere Präferenz für Substrate, die bereits durch andere Proteinkinasen präphosphoryliert wurden. Weitere Regulationsmechanismen stellen die zelluläre Lokalisation (Zytoplasma, Zellkern, Mitochondrien) und die Bildung von Komplexen (z.B. im Wnt-Signalweg) dar. Da bisher nur wenige GSK3β-assoziierte Proteinkomplexe bekannt sind, war es das Ziel dieser Arbeit, GSK3β-assoziierte Proteine systematisch aus Säugerzellen (HEK293T Zellen und HL-1 Kardiomyozyten) zu isolieren und zu identifizieren. Auf diese Weise sollten neue Erkenntnisse zur GSK3β-abhängigen Signaltransduktion und Funktion gewonnen werden. Hierzu wurde eine Kombination aus Tandem-Affinitätsreinigung und massenspektrometrischer Analyse (TAP/MS) angewendet, die eine Aufreinigung und Charakterisierung von GSK3β und ihren Interaktionspartnern unter nativen Bedingungen ermöglichte. Um die Proteininteraktionen in Abhängigkeit von der GSK3β-Aktivität zu analysieren, wurde eine konstitutiv aktive GSK3β-Mutante (Serin 9 -> Alanin 9) und eine inaktive GSK3β-Mutante (Lysin 85,86 -> Alanin 85,86) generiert. Mittels der TAP/MS-Analyse wurden neben bekannten (β-Catenin, Axin-1, APC) auch neue GSK3β-Interaktionspartner identifiziert. Von vier ausgewählten neuen GSK3β-Interaktionspartnern wurden drei Proteine (Filamin A (FLNA), Acetyl CoA Carboxylase 1 (ACC1) und Proteinkinase A I α (PKAIα)) mittels Proximity Ligation Assay (PLA) verifiziert. Die Interaktionen wurden auch für die wildtypische endogen exprimierte GSK3β bestätigt. Für Filamin A zeigte sich, dass es in HEK293T Zellen vornehmlich mit der aktiven Form von GSK3β interagiert. Die ACC1 und PKAIα wurden hingegen in beiden Zelllinien als GSK3β-Interaktionspartner bestätigt. Mittels der TAP/MS-und der PLA-Methode konnte gezeigt werden, dass die PKAIα bevorzugt mit der aktiven GSK3β-Form interagiert und diese Komplexbildung somit von der GSK3β-Aktivität abhängig ist. Detaillierte Untersuchungen des GSK3β/PKAIα-Komplexes in HEK293T Zellen zeigten, dass die inaktive GSK3β-Mutante nur schwach mit der PKAIα assoziiert war. Ein ähnlicher Befund konnte für eine hormonell (Insulin) und pharmakologisch (Lithiumchlorid) vermittelte Hemmung der GSK3β gezeigt werden, denn diese führten auch zu einer Dissoziation des GSK3β/PKAIα-Komplexes. Im Gegensatz dazu steigerte eine GSK3β-Aktivierung (PI3K-Inhibitor LY294002) die Komplexbildung. Im Unterschied zur GSK3β-Inhibition konnte durch PKA-Hemmung (PKA-Inhibitor: H89) kein wesentlicher Einfluss auf den Komplex festgestellt werden. Eine PKA-Aktivierung (cAMP-Analogon: 8-Br-cAMP) hatte hingegen zur Folge, dass die katalytische Domäne fast vollständig und die regulatorische Domäne teilweise vom Komplex dissoziierten. Die GSK3β-Serin 9-Phosphorylierung wurde durch eine PKA-Hemmung bzw. -Aktivierung vermindert bzw. gesteigert. Schlussfolgerung: TAP/MS-Analyse von GSK3β-assoziierten Proteinen ist eine effizienter experimenteller Ansatz, der über die Identifizierung neuer Interaktionspartner auf eine enge Verzahnung der GSK3β mit der Regulation des Metabolismus, des Zytoskeletts und insbesondere der cAMP-abhängige Signaltransduktion hinweist. The glycogen synthase kinase 3 beta (GSK3β) is a protein kinase which is involved in numerous cellular functions ranging from metabolism and growth to differentiation. GSK3β is constitutively active and can be inhibited by phosphorylation on serine 9 by e.g. AKT or PKC. In contrast to that, a phosphorylation at tyrosin 216 increases the GSK3β activity. GSK3β prefers substrates which are pre-phosphorylated by other protein kinases. Additional regulation mechanisms are dinstinct cellular localisations (cytoplasm, nucleus, mitochondria) or complex formations (e.g. Wnt-pathway) of GSK3β with other proteins. Today little is known about GSK3β associated proteins or complex formation. To investigate GSK3β-dependent signalling and its regulation in the context of protein interactions, the aim of this study was the systematic analysis of GSK3β associated proteins in eukaryotic cells (HEK293T and HL-1 cardiomyocytes). A combination of tandem affinity purification and mass spectrometry (TAP/MS) enabled the purification and characterization of GSK3β and its interacting proteins under native conditions. Beside known interaction partners of GSK3β (β-Catenin, Axin-1, APC) also new ones were identified with the help of TAP/MS analysis. To analyze whether the protein interactions depend on the catalytic activity of GSK3β, a constitutively active mutant (serine 9 -> alanine 9) and an inactive mutant (lysine 85, 86 -> alanine 85,86) of GSK3β were generated. Three out of four new GSK3β interaction partners (filamin A (FLNA), acetyl CoA carboxylase 1 (ACC1) and protein kinase A I α (PKAIα)) were verified via proximity ligation assay (PLA). The interactions were also confirmed for endogenous GSK3β in wildtype cells. Thereby it has been discovered, that filamin A and GSK3β interact only in HEK293T cells and there in particular, when GSK3β is active. ACC1 and PKA have been confirmed as GSK3β interacting proteins in both cell lines. In addition, it was shown that the interaction of GSK3β and PKAIα depends on GSK3ß-activity, as PKAIα interacts preferentially with the active form of GSK3ß. Further analysis of the GSK3β/PKAIα complex in HEK293T cells revealed a weak interaction of PKAIα with inactive GSK3β mutants. Similar findings were shown for hormonal (insulin) and pharmacological (lithium chloride) inhibition of GSK3β as this led also to a dissociation of the GSK3β/PKAIα complex. In contrast to that, activation of GSK3β (PI3K inhibitor LY294002) increased the complex formation. In contrast to the GSK3β-mediated effects, an inhibtion of PKA (H89: PKA inhibitor) had no essential effect on the GSK3β/PKAIα complex formation. However, a dissociation of almost the complete catalytic domain and a part of the regulatory domain of PKA from the complex, after PKA-activation with 8-Brom cAMP was detectable. In addition to that, the GSK3β-serine 9-phosphorylation was decreased or was detectable increased respectively by PKA inhibition or activation. Conclusion: TAP/MS analysis of GSK3β associated proteins is a powerful tool for the identification of new interaction partners. These newly discovered protein interactions point to the deep involvement of GSK3β in regulation of metabolism, cytoskeleton and in particular cAMP dependent signal transduction.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät
Dokument erstellt am:	30.01.2013
Dateien geändert am:	30.01.2013
Promotionsantrag am:	20.11.2012
Datum der Promotion:	18.01.2013