Dokument: Modulation der Aktivität ausgewählter Multidrogen-Resistenz-ABC-Transporter
| Titel: | Modulation der Aktivität ausgewählter Multidrogen-Resistenz-ABC-Transporter | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=23638 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20130130-122137-8 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Deutsch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Infed, Nacera [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Prof. Dr. Schmitt, Lutz [Gutachter] PD Dr. Schulte, Ulrich [Gutachter] | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik » 540 Chemie | |||||||
| Beschreibungen: | Der Begriff „multidrug-resistance“ (MDR) beschreibt das Phänomen bei dem Zellen nach Exposition mit einem Zellgift eine allgemeine Resistenz gegen strukturell unterschiedliche Substanzen erlangen. Dieses allgemeine Phänomen kann bei allen Zellen/Organismen beobachtet werden und unterbindet bei Krebszellen und pathogenen Mikroorganismen den Erfolg von Chemotherapien. Dafür verantwortlich sind unter anderem MDR-Proteine, die den Efflux dieser toxischen Substanzen ermöglichen. Zahlreiche, vor allem humane, MDR-Proteine gehören zur Superfamilie der „ATP-binding cassette“ (ABC)-Transporter. ABC-Transporter sind Membranproteine, die die bei der ATP-Hydrolyse freiwerdende Energie zum aktiven Transport von Subtanzen über eine biologische Membran verwenden. Um einem unerwünschten MDR-Phänotyp entgegenwirken zu können, sind die genaue Charakterisierung dieser Proteine und die Entwicklung spezifischer Inhibitoren von großer Bedeutung, und daher Gegenstand dieser Arbeit.
Im ersten Teil dieser Arbeit wurde der MDR-ABC-Transporter LmrA aus Lactococcus lactis, biochemisch charakterisiert. Dazu wurde LmrA jeweils mit Dodecyl-β-D-maltosid und FosCholin 16 isoliert und in Liposomen rekonstituiert. Anhand des isolierten Proteins, das in einer Detergenzlösung vorlag oder sich nach Rekonstitution in einer Lipid-Umgebung befand, konnte die Kinetik der ATP-Hydrolyse vergleichend untersucht werden. Es konnte festgestellt werden, dass obwohl in Dodecyl-β-D-maltosid solubilisiertes LmrA eine sehr geringe basale ATPase-Aktivität aufwies, nach Rekonstitution in einer Lipidumgebung eine hohe Aktivität wiederhergestellt werden konnte. Während sich das gegenteilige Bild unter Verwendung von FosCholin 16 ergab. Desweiteren wurde der Einfluss eines bekannten Substrats (Rhodamin 123) auf die Aktivität, unter den verschiedenen Bedingungen vergleichend untersucht. Lediglich die LmrA-Proben mit hoher basaler ATPAse-Aktivität zeigten eine Substratsimulation, die aber bei allen maximal das 1,6-fache der jeweiligen basalen Aktivität entsprach. Weiterhin wurde beobachtet, dass die Expression einer ATPase inaktiven Mutante von LmrA (E512Q-LmrA) eine morphologische Veränderung der Lactococcus lactis Zellen bewirkte. Diese Zellen sind im Vergleich verlängert (1µm vs. 0,2 µm) und ähneln Stäbchen-förmigen Bakterien. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden 26 Zosuquidar-Derivate auf ihr Potential hin untersucht die Aktivität von mikrobiellen MDR-ABC-Transportern zu modulieren. Zosuquidar wurde als Inhibitor des P-Glykoproteins, einem humanen MDR-Protein, entwickelt. Um eine Aussage darüber treffen zu können, ob und inwiefern Zosuquidar-Derivate einen Effekt auf die Aktivität von mikrobiellen MDR-Proteinen haben, wurden bei dem in dieser Arbeit vorliegenden Screening die Wirkung auf drei verschiedenen Proteinen untersucht, LmrA und LmrCD aus Lactococcus lactis und Pdr5 aus Saccharomyces cerevisiae. Während LmrCD als Modellsystem für MDR-ABC-Transporter pathogener Gram-positiver Bakterien gilt, kommt diese Rolle Pdr5 für dessen Homologe in pathogenen Pilzen zu. Bereits in früheren Studien wurde gezeigt, dass P-Glykoprotein-Inhibitoren die Aktivität von LmrA ähnlich beeinflussen können wie das P-Glykoprotein. Für jedes dieser Proteine konnten Substanzen identifiziert werden, die einen stärkeren Einfluss auf die Aktivität hatten als die Ausgangssubstanz Zosuquidar.Multidrug resistant (MDR) cancer cells and an increasing number of multidrug resistant pathogenic microorganisms are serious public health issues. Transporters that accomplish the extrusion of the therapeutic agents/toxic substances are often responsible for the MDR phenotype. The so called MDR transporters are characterized by a broad substrate spectrum that contains a range of structurally and functionally unrelated toxic agents. Many MDR transporters, especially human MDR proteins, are ATP-binding cassette (ABC) transporters. ABC transporters are membrane proteins that use the energy released by ATP hydrolysis for active transport of substances across a biological membrane. Characterization of these ABC-type MDR proteins as well as the development of new specific inhibitors are important approaches to reverse the undesirable MDR phenotype and therefore subjects of this thesis. In the first part of this thesis the ABC transporter LmrA from Lactococcus lactis was studied. This transporter has been intensively studied in the past and a role in multidrug resistance was proposed. The kinetics of ATP hydrolysis and the effect of a substrate (Rhodamine 123) were studied for isolated LmrA in detergent solution and in proteoliposomes. In detergent solution, LmrA purified with Fos-Choline-16 was highly active with respect to ATPase activity, which could be stimulated by a substrate of LmrA. Both, high basal ATPase activity and substrate stimulation were not detected for LmrA solubilized in dodecyl-β-D-maltoside (DDM). After reconstitution of the protein into liposomes, the LmrA samples, which were purified with DDM, showed activity similar to that measured using membrane vesicles prepared from Lactococcus lactis, whereas the samples with Fos-Choline-16 showed a reduced activity. The active LmrA samples in all three environments, in FosCholine16-solution, in liposomes where DDM was used and in isolated membrane vesicles, displayed similar determined Km-values about 0.7 mM for ATP. The maximal stimulation to a 1.6 –fold of the basal ATPase activity by Rhodamine 123 was also seen for all three active LmrA samples. Moreover a morphological change induced by expression of an ATPase inactive mutant of LmrA (E512Q-LmrA) was observed. These Lactococcus lactis cells developed a longated size similar to rod-shape bacteria instead of the usual spherical shape. In the second part zosuquidar derivatives have been tested towards their ability to modulate the activity of microbial ABC-type MDR transporters. Zosuquidar was developed as an inhibitor for human multidrug resistance efflux pumps, such as P-glycoprotein. Two transporters from Lactococcus lactis, LmrA and LmCD, and a transporter from Saccharomyces cerevisiae Pdr5 were selected for this screening. The effects on the ATPase activity as well as on the transport activity were monitored. Most of the substances that showed an influence on the activity, effected the transport activity to a higher extend than the hydrolysis of ATP. It was possible to identify substances that had a greater impact on the transport activity than zosuquidar for all three proteins. | |||||||
| Lizenz: |  Urheberrechtsschutz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Chemie » Biochemie | |||||||
| Dokument erstellt am: | 30.01.2013 | |||||||
| Dateien geändert am: | 30.01.2013 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 11.12.2012 | |||||||
| Datum der Promotion: | 28.01.2013 |
