Dokument: A systems biology approach and single gene analysis to identify transporters and regulatory proteins in the plant carbon cycle

Titel:	A systems biology approach and single gene analysis to identify transporters and regulatory proteins in the plant carbon cycle
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=23589
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20130128-125946-6
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Dipl.-Biol. Pick, Thea Renate [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 7,50 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 24.01.2013 / geändert 24.01.2013
Beitragende:	Prof. Dr. Weber, Andreas P. M. [Gutachter] Prof. Dr. Westhoff, Peter [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Green plants fix inorganic carbon dioxide (CO2) by Ribulose 1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase (Rubisco) in a process called photosynthesis. This carboxylation reaction of Rubisco generates two molecules of 3-phosphoglycerate (3-PGA) and finally leads to biomass production. Hence plants account for a significant share of the global organic carbon pool. While most plants use the original C3 type of photosynthesis for CO2 assimilation some of the most important crop plants on earth like maize (Zea mays) use a highly efficient type of photosynthesis, namely C4 photosynthesis. In C4 photosynthesis CO2 is prefixed by an oxygen (O2) insensitive enzyme into a C4 acid and concentrated in close vicinity of Rubisco. This leads to a high efficiency of photosynthesis through a reduced rate of photorespiration that is caused by the oxygenation reaction of Rubisco. Although Rubisco strongly favors CO2, the enzyme can also accept O2 as a substrate. The product of the oxygenation reaction is one molecule of 3-PGA and one molecule of 2-phosphoglycolate (2-PG). The latter can neither enter the Calvin cycle nor be converted to carbohydrates. This can lead to a dramatic decrease in biomass production since 2-PG has to be recycled at the cost of energy and reduction equivalents in the photorespiratory cycle. The photorespiratory cycle is a highly compartmentalized pathway involving metabolic reactions in the chloroplasts, peroxisomes, mitochondria, and the cytosol. The mass flow through this pathway is only excelled by photosynthesis and therefore requires a tight and fast connection between the different compartments. This is obtained through highly specific metabolite transporters that account for the shuttle of precursors, intermediates and products across the membranes. It has previously been shown that short-circuiting of the photorespiratory cycle led to enhanced biomass production in C3 plants. This important finding verifies the significance of research for molecular plant engineering as a significant share of the components of the pathway, such as metabolite transporters and regulatory proteins are still unknown. Therefore one aim of this thesis was the identification of photorespiratory metabolite transporters since all genes encoding enzymes required for appropriate function of the core cycle are known to date while no transporter has been characterized on the molecular level. In a reverse genetics screen Plastidic glycolate glycerate transporter 1 (PLGG1) was designated as a promising candidate. Molecular characterization of the candidate was used to identify expression pattern and subcellular localization. An A. thaliana (Arabidopsis thaliana) T-DNA insertional knockout mutant (plgg1-1) was isolated and characterized concerning its phenotype and steady state and dynamic metabolite accumulation. Biochemical characterization of the candidate was used to identify transport capacity and to define the role of PLGG1 in plant metabolism. The molecular characterization revealed that PLGG1 is expressed in all green tissues and that it is located at the chloroplast envelope. Analysis of the knockout mutant revealed that plgg1-1 plants show a photorespiratory phenotype and the photorespiratory metabolites glycolate and glycerate accumulate in the mutant. Finally the biochemical characterization indicated that glycolate and glycerate transport are impaired in the mutant. These analyses lead to the discovery of PLGG1 as the chloroplastidic glycolate glycerate transporter and thereby to the identification of the first transporter of the core photorespiratory pathway. Surprisingly PLGG1 was found to be high abundant in maize chloroplast what is somehow counter intuitive as PLGG1 is a photorespiratory transporter and the rate of photorespiration is reduced in the C4 plant maize. Until today the role of PLGG1 in C4 photosynthesis is still unresolved and emphasizes the question how the C4 cycle is organized and how the establishment of C4 photosynthesis is orchestrated since the C4 cycle is obviously not as linear and simple at is has been assumed. Therefore the second aim of this thesis was to set up a systems biology approach to find candidates for unidentified components of the C4 pathway, such as metabolite transporters and regulatory proteins. The third leaf of the C4 model plant maize was analyzed along a base-to-tip developmental gradient. Ten continuous leaf slices were analyzed individually and transcriptome analysis, oxygen sensitivity of photosynthesis, photosynthetic rate measurements, and chlorophyll and protein measurements revealed a gradual sink-to-source transition for the leaf without a binary on-off switch. Analysis of transcription factors exhibiting a similar expression pattern to key C4 enzymes along the leaf gradient designated in a list of putative regulatory proteins orchestrating the establishment of C4 photosynthesis. Finally, transcriptome and metabolome analysis, enzyme activity measurements, and quantification of selected metabolites showed that the C4 cycle is not linear but rather a branched cycle. These results led to a revised model of maize C4 photosynthesis. Grüne Pflanzen fixieren anorganisches Kohlendioxid (CO2) mit Hilfe des Enzyms Ribulose 1,5-bisphosphate Carboxylase/Oxygenase (Rubisco) in dem Prozess, der als Photosynthese bezeichnet wird. In der Carboxylierungsreaktion werden zwei Moleküle 3-Phosphoglycerat (3-PGA) gebildet, die letztendlich zur Produktion von Biomasse verwendet werden. Daher tragen Pflanzen zu einem erheblichen Teil des weltweiten organischen Kohlenstoff-Pools bei. Während ein Großteil der Pflanzen dabei den ursprünglichen C3-Typ der Photosynthese betreiben, gibt es einige Pflanzen, unter denen sich wichtige Nutzpflanzen wie Mais (Zea mays) befinden, die einen hoch effizienten Photosynthese-Typ betreiben, nämlich C4 Photosynthese. In der C4 Photosynthese wird CO2 durch ein Sauerstoff (O2) unempfindliches Enzym in eine C4 Säure vorfixiert und in unmittelbarer Nähe zur Rubisco angereichert. Diese Vorfixierung führt zu einer hohen Effizienz der Photosynthese, da die Photorespiration, hervorgerufen durch die Oxygenierungsreaktion der Rubisco, gesenkt wird. Denn obwohl die Rubisco verstärkt CO2 bevorzugt, kann das Enzym auch O2 als Substrat verwenden. Die Produkte dieser Oxygenierungsreaktion sind je ein Molekül 3-PGA und ein Molekül 2-Phosphoglycolat (2-PG). Letzteres kann weder in den Calvin-Zyklus eintreten, noch in Kohlenhydrate umgewandelt werden. 2-PG muss daher im photorespiratorischen Zyklus unter Verbrauch von Energie und Reduktionsäquivalenten regeneriert werden, wodurch die Produktion von Biomasse drastisch reduziert werden kann. Der photorespiratorische Zyklus ist stark kompartimentiert und beinhaltet metabolische Reaktionen in den Chloroplasten, den Peroxisomen, den Mitochondrien und dem Zytosol. Die Durchflussmenge von Metaboliten durch diesen Stoffwechselweg wird nur von der Photosynthese übertroffen und erfordert daher eine dichte und schnelle Verknüpfung der Kompartimente untereinander. Diese Verknüpfung wird durch hochspezifische Metabolit Transporter erzielt, die Vor-, Zwischen und Endprodukte über Membranen transportieren. Es konnte bereits gezeigt werde, dass ein Verkürzen und Kurzschließen der Photosynthese zu einer erhöhten Produktion von Biomasse in C3 Pflanzen führt. Diese wichtige Erkenntnis bekräftigt die Wichtigkeit der Forschung an molekularer Pflanzentechnik, da weiterhin wichtige Komponenten des Stoffwechselweges, wie etwa Metabolit Transporter und regulatorische Proteine, unbekannt sind. Daher war ein Ziel dieser Arbeit photorespiratorische Metabolit Transporter zu identifizieren, da alle Gene, die für unabdingbare Enzyme des Hauptzyklus kodieren, bekannt sind, während bisher kein Transporter molekular charakterisiert werden konnte. Mit Hilfe reverser Genetik konnte Plastidic glycolate glycerate transporter 1 (PLGG1) als ein vielversprechender Kandidat isoliert werden. Die molekulare Charakterisierung des Kandidaten wurde zur Untersuchung des Expressionsmusters und der zellulären Lokalisation verwendet. Eine A. thaliana (Arabidopsis thaliana) knockout Linie, die eine T-DNA Insertion im Gen trägt (plgg1-1), konnte isoliert werden und wurde auf den Phänotypen und stationäre und dynamische Metabolit Anreicherung untersucht. Die biochemische Charakterisierung wurde durchgeführt, um die Transporteigenschaften zu bestimmen und die Rolle von PLGG1 im pflanzlichen Stoffwechsel zu klären. Die molekulare Charakterisierung ergab, dass PLGG1 in allen grünen Geweben exprimiert wird und an der Chloroplasten Hülle lokalisiert ist. Die Analyse der knockout Linie zeigte, dass die plgg1-1 Pflanzen einen photorespiratorischen Phänotyp aufweisen und die photorespiratorischen Metabolite Glycolat und Glycerat angereichert werden. Schließlich zeigte die biochemische Charakterisierung, dass der Transport von Glycolat und Glycerat in plgg1-1 Pflanzen beeinträchtigt ist. Diese Untersuchungen führten zu der Entdeckung von PLGG1 als den chloroplastiäre Glycolat Glycerat Transporter und damit zur Identifizierung des ersten Transporters des photorespiratorischen Hauptkreislaufs. Überraschender Weise wurde zudem festgestellt, dass PLGG1 sehr stark in Mais Chloroplasten vertreten ist, was eigentlich widersprüchlich ist, da PLGG1 ein photorespiratorischer Transporter ist und die Photoresirationsrate in der C4 Pflanze Mais stark reduziert ist. Bisher ist die Rolle von PLGG1 in der C4 Photosynthese noch ungeklärt und verstärkt die Frage wie der C4 Zyklus organisiert ist und wie die Ausbildung des C4 Syndroms gesteuert wird, da der C4 Zyklus offenbar nicht so linear und schlicht ist, wie es bisher angenommen wurde. Daher war das zweite Ziel dieser Arbeit Kandidaten für unbekannte Komponenten des C4 Kreislaufs, wie etwa Metabolit Transporter und regulatorische Proteine, zu finden, indem ein Systembiologischer Ansatz durchgeführt wurde. Das dritte Blatt der C4 Modellpflanze Mais wurde entlang eines Entwicklunsgradienten von der Basis bis zur Spitze untersucht. Dafür wurden zehn fortlaufende Blattabschnitte individuell analysiert und das Transkriptom, Sauerstoff Empfindlichkeit der Photosynthese, Photosyntheserate, Chlorophyll- und Proteingehalt gemessen. Die Ergebnisse zeigten, dass es im Blatt einen schrittweise Übergang von Sink zu Source Geweben gibt, ohne einen binären an-aus Schalter. Eine Liste möglicher regulatorischer Proteine, die die Ausbildung des C4 Syndroms steuern, konnte erstellt werden indem Transkriptionsfaktoren, die ein ähnliches Expressionsmuster wie wichtige C4 Enzyme aufweisen, analysiert wurden. Die Analyse des Transkriptoms und Metaboloms, sowie die Bestimmung der Enzymaktivität und die Quantifizierung ausgewählter Metabolite ergab, dass der C4 Kreislauf nicht linear, sondern eher verzweigt abläuft. Diese Ergebnisse führten zu einer Änderung des bisherigen Modells der C4 Photosynthese in Mais.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » Biochemie der Pflanzen
Dokument erstellt am:	28.01.2013
Dateien geändert am:	28.01.2013
Promotionsantrag am:	02.09.2012
Datum der Promotion:	08.10.2012