Dokument: Etablierung und Evaluierung eines auf Mikrogeweben basierenden Knochengewebes
| Titel: | Etablierung und Evaluierung eines auf Mikrogeweben basierenden Knochengewebes | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=23576 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20130308-121622-9 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Deutsch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | MSc Langenbach, Fabian [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Prof. Dr. Dr. Handschel, Jörg [Betreuer/Doktorvater] Prof. Dr. Klein, Thomas [Gutachter] Prof. Dr. Wiesmann, Hans-Peter [Gutachter] | |||||||
| Stichwörter: | osteogenes Tissue Engineering, multipotente Stammzellen, dreidimensionale Zellkultur, Mikrogewebe, kumulative Dissertation | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie | |||||||
| Beschreibungen: | Große nicht selbstständig heilende Knochendefekte und kleinere schlecht oder langsam heilende Defekte machen therapeutische Maßnahmen zur Knochenregeneration oder zum Knochenaufbau notwendig. Als Alternative zu klassischen Therapien wird dem osteogenen Tissue Engineering (TE) großes Potential beigemessen. Zur Herstellung von TE-Knochentransplantaten (TEKT) in vitro werden in der Regel multipotente Stammzellen in der zweidimensionalen (2D) Zellkultur herangezüchtet und vor der Implantation mit einem geeigneten Gerüst kombiniert. Wachstumsraten, Differenzierungsverhalten und Transkriptionsprofile haben jedoch gezeigt, dass Zellen in dreidimensionalen (3D) Zellkulturen deutlich ähnlichere Eigenschaften verglichen mit Zellen in vivo aufweisen. Daher war das Ziel dieser Arbeit die Entwicklung, Analyse und präklinische Anwendung eines TEKT auf Basis von 3D Mikrogeweben (MG) in Kombination mit einem geeigneten Biomaterial.
Multipotente unrestringierte somatische Stammzellen aus humanem Nabelschnurblut wurden zu sphärischen osteogenen MG differenziert, die schneller als 2D Kulturen mineralisierten. Dabei zeigte sich, dass die MG auch ohne die Zugabe von osteogenen Wachstumsfaktoren spontan osteogen differenzierten. Bevor jedoch osteogene MG für das TE verwendet werden konnten, musste sichergestellt werden, dass Zellen aus differenzierten MG in die Umgebung auswachsen können, um zellfreie Bereiche im Gerüst zu kolonisieren. Daher wurden MG einen, zwei drei und fünf Tage osteogenem Medium ausgesetzt und anschließend auf eine Zellkulturoberfläche ausgesetzt. Es zeigte sich, dass mit zunehmender Dauer der osteogenen Vordifferenzierung die Anzahl und die Distanz von auswachsenden Zellen deutlich zurückgingen. Dabei wurde eine optimale osteogene Differenzierung bei gleichzeitiger Erhaltung der Auswuchsfähigkeit für einen Zeitraum von drei Tagen beobachtet. Da die gleichen Effekte auch in Extrazellulärem Matrix (EZM)-Gel bestätigt wurden, lies sich schließen, dass Zellen vermutlich auch in vivo in die EZM eindringen können und somit der Besiedelung von Zwischenräumen keine Grenze gesetzt ist [1]. Zwecks der Standardisierung des Herstellungsprozesses, der Bestimmung von Variationsmöglichkeiten in Größe und Kulturdauer, sowie der Etablierung von histologischen und molekularbiologischen Analysemethoden wurde ein detailliertes Protokoll zur osteogenen MG-Kultur erarbeitet. Dabei zeigte sich, dass MG leicht in variablen Größen hergestellt werden können. Wegen gewisser Nachteile in der Spezifizität von Alizarin Rot S und der Von Kossa Färbung zur Detektion des Knochenspezifischen Minerals Hydroxylapatit (HA) wurde ein kommerziell erhältlicher, für die Fluorimetrie entwickelter HA-spezifischer Fluoreszenzfarbstoff für die Histologie adaptiert. Dadurch konnte die Sensitivität der Mineraldetektion in MG sowie in Einzelzellschichten im Vergleich zu herkömmlichen histologische Färbeprotokollen deutlich erhöht werden [2]. Histologische Methoden reichen jedoch für die Bestimmung der genauen Mineralzusammensetzung nicht aus. Mittels Raster- und Transmissions-Elektronenmikroskopie (REM und TEM), Röntgenstrukturanalyse sowie Ramanspektroskopie konnte festgestellt werden, dass sich die Mineralien der osteogen differenzierten (+DAG) und Kontroll-MG (-DAG) signifikant in der Verteilung, Struktur und Zusammensetzung unterschieden. Es fanden sich calcium-defizitäres-HA (CDHA) und amorphes Calciumphosphat (ACP) in den -DAG Geweben und ACP, Octa-Calciumphosphat, (Mg-)Whitlockit, HA und CDHA in den +DAG Geweben. Durch die Zugabe von β-Glycerolphosphat kann es in Kombination mit Apoptose der Zellen zu einer dystrophischen Mineralisierung kommen. Zum Ausschluss falsch positiver Ergebnisse für die Mineralisation konnte mittels TUNEL-Assay die Apoptose von Zellen als Ursache für die Mineralisation ausgeschlossen werden [3]. Um ein geeignetes Biomaterial für das TE zu finden wurden verschiedene Materialien hinsichtlich ihrer Biokompatibilität mit USSC untersucht: multiporöses β-Tricalciumphosphat (β-TCP), uniporöses β-TCP, deproteinierte Spongiosa, demineralisierte Spongiosa (ICBM) und Kollagenschwamm wurden mit Zellen besät und kultiviert. Mittels fluorimetrischer Zellzahlbestimmung und REM konnte ICBM als das Material mit den besten Eigenschaften für die Anhaftung und die Proliferation von USSC bestimmt werden [4]. Daher wurden anschließend ICBM mit MG kombiniert. Durch das Einsetzen von MG in ICBM konnten bis zu 40-mal mehr Zellen auf ein Gerüst gegeben werden als durch Einzelzellbesiedelung möglich gewesen wäre. Zudem konnte ein schneller Auswuchs an Zellen erreicht werden, wodurch in kurzer Zeit Bereiche zwischen den Spongiosabälkchen ausgefüllt wurden [5]. Zur Analyse des osteogenen Potentials von USSC-ICBM- und MG-ICBM-Konstrukten wurden sie in Muskeltaschen auf dem Rücken von Ratten implantiert und die Neubildung von Knochen wurde mittels Computertomographie und Histologie ausgewertet. Das Prinzip der osteogenen Vorbehandlung der Konstrukte basierte dabei auf den Erfahrungen bei den Auswuchsexperimenten. Es zeigte sich ektope Knochenbildung in den USSC-ICBM- und MG-ICBM-Konstrukten, während unbesiedelte ICBM nicht zur Bildung von Kochen beitrugen [6]. Zum besseren Verständnis der Mechanismen in der osteogenen Differenzierung von Stammzellen unter dem Einfluss von Dexamethason (DEX), Askorbinsäure (ASC) und β-Glycerolphosphat (β-GLY), wurde auch eine Literaturstudie angefertigt. Es scheint, dass DEX Stammzellen zur Differenzierung treibt, welche dann durch ASC und β-GLY in die Osteogenese gelenkt wird. DEX induziert die osteogene Differenzierung durch eine Hochregulation von TAZ (transcriptional co-activator with PDZ-binding motif), welches mit dem Master Transkriptionsfaktor Runx2 interagiert. Zusätzlich wird die Runx2 Aktivität durch die DEX-induzierte Hochregulation der Mitogen-aktivierten-Protein-Kinase(MAPK)-Phosphatase (MKP-1) reguliert. ASC trägt zur osteogenen Differenzierung als Ko-Faktor in der Kollagen Typ I Synthese bei, wodurch der Aufbau einer osteogenen EZM und somit die osteogene Differenzierung beschleunigt wird. Das Phosphat in β-GLY wird in HA (Ca10(PO4)6(OH)2) eingebaut und dringt zusätzlich in die Zelle ein, wo es durch Phosphorylierung der „Extracellular signal related Kinase (ERK)“ zur Expression von vielen verschiedenen Knochenproteinen beiträgt [7]. Um die oben genannten Arbeiten in den literarischen Kontext des jetzigen Forschungsstandes einzuordnen wurde eine Literaturstudie durchgeführt und ein Review angefertigt. Dabei wurden unter Anderem drei mögliche Ursachen für die beschleunigte und die spontane osteogene Differenzierung der MG ermittelt. Erstens trägt vermutlich der 3D-Kontakt zu EZM-Proteinen zur Differenzierung bei. Dabei übertragen Integrine extrazelluläre Reize mittels fokaler Adhäsionskinase an den MAPK Signalweg, wodurch Runx2 phosphoryliert wird und es zur Expression von osteogenen Proteinen kommt. Ein zweiter Grund ist die hohe Zelldichte innerhalb der MG. Durch den engen Kontakt der Zellen zueinander können parakrine osteogene Faktoren besser zur Osteogenese beitragen als bei vereinzelten Zellen. Drittens führen autokrine BMP2 Signale zu einer verstärkten Osteogenese. Durch die dreidimensionale Kultur von Stammzellen aus dem Knochenmark kommt es sowohl in osteogenem Medium als auch in Kontrollmedium zu einer vielfach höheren BMP2 Expression, die anschließend zu einer erhöhten Expression von Collagen Typ I, Runx2 und weiteren osteogenen Proteinen führt [8]. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass osteogene MG verbesserte in vivo ähnlichen Bedingungen aufzeigen und ihre schnelle Differenzierung, sowie die präzise Applizierbarkeit bedeutende Vorteile gegenüber 2D Zellkulturen bieten. Mit MG kann die Effizienz bei dem Beimpfen von Gerüsten verbessert und die Anzahl von Zellen im Gerüst deutlich erhöht werden. Darüber hinaus verringern MG sowohl beim Tissue Engineering als auch bei gerüstfreien Zelltherapien die Gefahr des Auswaschens und der ungewünschten Verteilung der Zellen. Mit der Fähigkeit zur ektopen Knochenbildung in vivo bilden Kombinationen aus MG und geeigneten Gerüsten wie ICBM einen höchst vielversprechenden Ansatz zur Rekonstruktion von großen Knochendefekten.Summary Large bone defects that do not heal spontaneously and smaller slow-healing defects necessitate therapeutic measures for bone regeneration or bone augmentation. As an alternative to classic therapies, osteogenic tissue engineering (TE) is regarded as a promising technology for bone regeneration. As a standard procedure multipotent stem cells are incubated in two-dimensional (2D) cell cultures before they are combined with scaffolds, to form a TE bone graft (TEBG) that is implanted. However, analysis of growth rates, differentiation characteristics and transcription profiles revealed that cells in a 3D-environment have similar properties to cells in vivo. Therefore, the aim of the work was the development, analysis and preclinical application of a TEBG based on 3D microtissues (MTs) in combination with a suitable biomaterial. Multipotent human stem cells from umbilical cord blood (USSC) have been differentiated to spherical osteogenic MTs, which mineralized faster than 2D cell cultures. Moreover, also control microspheres that have been treated without osteoinductive agents mineralized spontaneously. However, prior to the use of MTs for TEBGs, it had to be ensured that cells are able to migrate out of osteogenic differentiated MTs to colonize spaces in the scaffold. For this purpose, MTs were treated for one, two, three and five days with osteogenic medium and afterwards were seeded on a cell culture surface. It was found that with increasing duration of osteogenic predifferentiation the number and distance of outgrowing cells constantly decreased. The optimum duration for an osteogenic predifferentiation, while retaining the ability of cells to migrate out of the MT, was found to be 3 days. Since the same effect was found in extracellular matrix (ECM)-gel, it was concluded that probably also cells in vivo, have the ability to migrate into the surrounding and to fill up cell free spaces [1]. In order to standardize the generation process, a detailed protocol for the osteogenic differentiation of MTs cultures was established. This method allowed for defining the variability in size and culture period, as well as for the establishment of histological and molecular biologic analysis. It was found that MTs of variable but defined sizes can be generated. Due to disadvantages in the specificity of alizarin red S and Von Kossa stain for the detection of the bone specific mineral hydroxylapatit, a commercially available hydroxylapatit-specific fluorescent dye was adapted for histology. This method provided higher sensitivity in the mineral detection in MTs and in mono-layers compared to standard histological stains [2]. For the exact determination of the mineral content histological methods are not sufficient and cannot discriminate between dystrophic and bone specific mineralization. Through scanning electron microscopy (SEM), and transmission electron microscopy (TEM), energy dispersive x-ray spectroscopy and Raman spectroscopy, it was found that minerals in osteogenic differentiated (+DAG) and control MTs (-DAG) differ significantly in their distribution, structure and composition. Calcium-deficient hydroxyapatite (CDHA) and amorphous calciumphosphate (ACP) were found in –DAG-microtissues and ACP, octa-calciumphosphate, (Mg)Whitlockit, CDHA and HA were found in the +DAG-microtissues. Dystrophic mineralization after apoptosis of cells inside the MTs could be excluded by TUNEL-assay [3]. For the identification of a suitable biomaterial for osteogenic tissue engineering, various materials were compared with regard to their biocompatibility with USSC: multiporous β-Tricalciumphosphat, (β-TCP), uniporous β-TCP, deproteinized spongiosa, demineralized spongiosa (ICBM) and collagen sponge were seeded with cells and cultivated. Assay-based fluorimetric cell counting and SEM revealed the best results for attachment and proliferation of USSC on ICBM-scaffolds [4]. As a consequence from these findings, ICBM was combined with MTs. When inoculating ICBM with MTs a 40 fold increased cell number could be integrated in one scaffold, in contrast to inoculation with cell suspensions. During subsequent incubation, a fast outgrowth of cells could be observed, that filled spaces between the trabeculae of the scaffold within two weeks [5]. For the investigation of the osteogenic potential of USSC-ICBM- and MT-ICBM-Scaffolds the constructs were implanted into dorsal muscle bags of immuno-compromised rats, and ectopic bone formation was analyzed by computer-tomography and histology. The procedure of the osteogenic pretreatment was based on the results of the outgrowth experiment. It was found that ectopic bone formation was induced in USSC-ICBM- and MT-ICBM-scaffolds, whereas cell free ICBM did not lead to bone formation [6]. In order to understand the mechanisms behind the osteogenic differentiation of stem cells in response to dexamethasone (DEX), ascorbic acid (ASC) and β-glycerophosphate (β-GLY) a detailed review of the literature was performed. DEX seems to induce the differentiation of stem cells, which is then guided by ASC and β-GLY into osteogenesis. DEX induces differentiation by up-regulating TAZ (transcriptional co-activator with PDZ-binding motif), which interacts with the master osteogenic transcription factor Runx2. Moreover, Runx2 activity is regulated by DEX-induced up-regulation of the mitogen-activated protein kinase (MAPK) phosphatase (MKP-1). ASC contributes to osteogenic differentiation through its role as a co-factor in collagen synthesis, which results in the enhanced assembly of an osteogenic ECM and thereby enhances osteogenic differentiation. The phosphate of β-GLY is incorporated into the bone HA, (Ca10(PO4)6(OH)2), and also enters the cell where it phosphorylates extracellular signal related kinase (ERK) leading to the expression of many osteogenic genes [7]. In order to relate the publications resulting from this work to their scientific context the recent literature was reviewed. In doing so, three probable reasons that might be responsible for the improved and spontaneous osteogenic differentiation of MTs were determined. First, a 3D-contact to ECM-proteins seems to contribute to the differentiation. In this process integrins transmit extracellular cues via focal adhesion kinases to the MAPK pathway. This results in the phosphorylation of Runx2 which in turn leads to the expression of osteogenic proteins. A second reason could be the high cell density inside the MTs. Due to the close contacts of the cells to each other paracrine osteogenic factors can better unfold their potential compared to cells in monolayers. Third, autocrine BMP2 signals lead to an accelerated osteogenic differentiation. The 3D culture of bone marrow stem cells results in a strong increase in BMP2 expression in osteogenic and control medium, which is followed by an increase in the expression of collagen type I, Runx2 and other osteogenic proteins [8]. In conclusion, MTs offer improved in vivo-like conditions for stem cells than 2D cultures resulting in enhanced osteogenic differentiation. MT technology can ameliorate seeding efficiency of biomaterials and can increase the cell load of a scaffold. Furthermore, microtissues reduce the risk of unwanted cellular distribution and wash out in tissue engineering and scaffold free cell therapy. With their capability of ectopic bone formation MT-ICBM-constructs hold promise for facilitated, accelerated and improved bone regeneration. | |||||||
| Lizenz: |  Urheberrechtsschutz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie | |||||||
| Dokument erstellt am: | 08.03.2013 | |||||||
| Dateien geändert am: | 08.03.2013 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 11.06.2012 | |||||||
| Datum der Promotion: | 17.12.2012 |
