Dokument: Untersuchung der Funktion von Ergothionein durch Knockout des Ergothionein-Transporters des Zebrafisches Danio rerio

Titel:	Untersuchung der Funktion von Ergothionein durch Knockout des Ergothionein-Transporters des Zebrafisches Danio rerio
Weiterer Titel:	Investigation of the function of ergothioneine by knock-out of the ergothioneine transporter in zebrafish Danio rerio
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=23542
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20130122-122924-9
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Pfeiffer, Carolin [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 3,31 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 22.01.2013 / geändert 22.01.2013
Beitragende:	Prof. Dr. Proksch, Peter [Gutachter] Prof. Dr. Gründemann, Dirk [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Ergothionein (ET), ein Betain des L-Histidins, welches eine Mercaptogruppe in Position 2 des Imidazolrings trägt, ist ein pharmakologisch interessantes Molekül. Mutationen im humanen Ergothionein-Transporter (ETTh) sind mit chronisch entzündlichen Erkrankungen, wie Colitis Ulcerosa und Morbus Crohn assoziiert. In Patienten mit Katarakt ist der ET-Gehalt vermindert. ET ist aufgrund seiner Ladungen nicht membrangängig und so auf den aktiven Transport mit Hilfe eines Transporters (ETT, Gensymbol SLC22A4) angewiesen. In der verwendeten Zebrafisch-Knockout-Linie (ETT-/-, retrovirale Insertion in Exon 1) ist der ETT, welcher für die Aufnahme von ET aus der Nahrung notwendig ist, nicht mehr exprimiert. Die ETT-/--Fische weisen somit einen kompletten ET-Mangel auf. Zu Begin der Arbeit waren lediglich Pilze und Mykobakterien als ET-Produzenten bekannt. Innerhalb dieser Arbeit konnten durch Nachweis von ET und des Synthesezwischenproduktes Herzynin mittels LC-MS/MS-Messung Cyanobakterien als neue ET-Quelle entdeckt werden. Mit dem Cyanobakterium Spirulina platensis wird eine neue, sichere ET-Quelle für aquatische Lebewesen aber auch den Menschen aufgezeigt. Zum ersten Mal konnte mittels LC-MS/MS-Messungen ET in der Haut des adulten Zebrafisches nachgewiesen werden. Der Befund wurde durch Nachweis der ETT-Expression in der Haut mittels quantitativer RT-PCR bestätigt. Zur funktionellen Untersuchung des ET in vivo wurden Biomarker für oxidativen Stress (4-Hydroxy-2-nonenal, Malondialdehyd) mit Hilfe von LC-MS/MS-Messungen im Zebrafisch nachgewiesen. Für die Untersuchungen wurden ungestresste Tiere sowie Tiere unter schwermetallinduziertem oxidativem Stress analysiert. Es konnte kein reproduzierbarer, signifikanter Unterschied des Biomarker-Gehaltes zwischen ETT-/- und Wildtyp festgestellt werden. Zum ersten Mal wurde die Methode der LC-MS/MS-Differenzabtönung zur Detektion molekularer Unterschiede zwischen Zebrafischlinien verwendet. Komplette Organe adulter Zebrafische wurden vergleichend mit dieser Methode untersucht und signifikante Unterschiede zwischen Wildtyp und ETT-/- gezeigt. Die ETT-/--Fische enthalten in verschiedenen Organen signifikant weniger Carnitin und Acetylcarnitin. Zudem wurde ein signifikant höherer 8-Hydroxyguanin (8-OH-G)-Gehalt in der Haut der ETT -/--Fische nachgewiesen. Da das 8-OH-G einen Indikator für DNA-Läsionen darstellt liefern diese Untersuchungen einen Hinweis darauf, dass ET in ET-reichen Geweben DNA schützen könnte. Ergothioneine (ET), i. e. the betaine of histidine bearing a mercapto group at Position 2 of the imidazole ring, is a pharmacologic interesting molecule. Mutations within the human ergothioneine transporter (ETTh) are associated with chronic inflammatory diseases, such as Ulcerative colitis and Crohn´s disease. Patients suffering from cataract were found to have a decreased level of ET. Due to its ionic character ET ist not able to cross membranes. Therefore it is necessary that ET is transported actively by means of a membrane transporter (ETT, gene symbol SLC22A4). In the zebrafish knockout lineage used (ETT-/-, retroviral insertion in exon 1) the ETT necessary for ET uptake from food is not expressed. ETT-/- fish thus show a complete lack of ET. At the beginning of this study, fungi and some mycobacteria were only ET producers known. Within this work, cyanobacteria were discovered as a new ET source as they contain ET and its synthesis intermediate hercynine, which was shown by LC-MS/MS analysis. We thereby revealed Spirulina platensis as a new and safe ET source for aquatic organisms and even human beeings. Fort he first time, we showed the presence of ET in the skin of adult zebrafish by LC-MS/MS analysis. This finding was confirmed by proof of ETT expression in the skin using quantitative RT-PCR. In ordert o investigate the function of ET in vivo, biomarkers of oxidative stress, such as 4-hydroxy-2-nonenal and malondialdehyde, were determined in zebrafish by LC-MS/MS analysis. For this purpose, both unstressed fish and fish stressed with heavy metals to induce oxidative stress were analyzed. However, stably significant differences in the biomarker content between ETT-/- and wild type fish were not found. The method of LC-MS/MS difference shading was applied for the first time to detect molecular differences between the fish lineages. Complete organs of adult zebrafish were comparatively scanned with this method and significant differences between wild type and ETT-/- fish were shown. The knockout lineage contained significantly less carnitine and acetyl carnitine in various organs. In addition, a significantly increased 8-hydroxy guanine (8-OH-G) content in the skin of ETT-/- fish was shown. As 8-OH-G is an indicator of DNA lesions, there might be the possibility that ET protects DNA in ET rich tissues.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Pharmazie » Pharmazeutische Biologie und Biotechnologie
Dokument erstellt am:	22.01.2013
Dateien geändert am:	22.01.2013
Promotionsantrag am:	19.10.2012
Datum der Promotion:	16.01.2013