Dokument: Naturstoffe aus dem Endophyten Talaromyces wortmannii, deren Strukturaufklärung und Wirkungsmechanismen

Titel:	Naturstoffe aus dem Endophyten Talaromyces wortmannii, deren Strukturaufklärung und Wirkungsmechanismen
Weiterer Titel:	Natural Products from Endophytic Fungus Talaromyces wortmannii: Their Structure Elucidation and Mechanism of Actions
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=23431
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20130108-113246-7
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Bara, Robert [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 4,30 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 07.01.2013 / geändert 07.01.2013
Beitragende:	Prof. Dr. Peter Proksch [Gutachter] Prof. Dr. Kassack, Matthias U. [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Zusammenfassung Die Natur hat die Menschheit seit jeher mit einer großen und strukturell diversen Vielfalt pharmakologisch aktiver Verbindungen versorgt, die im Weiteren genutzt werden als hoch effektive Arzneistoffe im Kampf gegen eine Vielzahl tödlicher Krankheiten oder als Leitstrukturen für die Entwicklung neuer synthetisch generierter Arzneistoffe, die als Spiegelbilder ihrer natürlichen Vorbilder dienen. Wechselseitige Vergesellschaftungen zwischen einer Wirtspflanze und ihren bestimmten Endosymbionten gewähren nachweislich eine Vielzahl an Vorteilen für beide Partner, wie beispielsweise die Produktion an bioaktiven Sekundärmetaboliten durch den mikrobiellen Partner, welche zum Schutz der Wirtspflanze gegenüber Insekten und Parasiten beiträgt und dadurch einen erworbenen chemischen Verteidigungsmechanismus darstellt. Wie auch immer repräsentieren endophytische Mikroorganismen nicht nur ein enormes Reservoir neuer Naturstoffe mit Einfluß auf die chemische Ökologie, sondern bieten auch Möglichkeiten für die Verwendung in Medizin, Agrikultur und Industrie. In Anbetracht der Existenz von schätzungsweise 300.000 verschiedenen Arten hoher Pflanzen, jede als potentieller Wirt für ein oder mehr Endophyten, ist ein großer Pool an Pilzspezien und ihren bioaktiven Inhaltsstoffen in den kommenden Jahren zu entdecken. In Kapitel zwei werden die fünf neuen Bisdihydroantracen-Atropisomere Flavomannine B-D (2-4) und Talaromannins A (5) und B (6) beschrieben, die zusammen mit dem bereits bekanten Flavomannin A (1) aus dem endophytischen Pilz Talaromyces wortmannii isoliert wurden. Die Ihre Strukturen wurden mithilfe verschiedener spektroskopischer Methoden wie 1D (1H, 13C and DEPT) und 2D (COSY, HMQC, HMBC, ROESY) NMR Experimenten und Massenspektrometrie aufgeklärt. Die absolute Konfiguration von Flavomannin A (1) und (B) wurde mittels ECD Messungen untersucht. Das ECD Spektrum von Flavomannin A (1) wurde geprägt von einem positiven Exziton-Couplet um 277 nm, wohingegen Flavomannin B (2) im Gegensatz dazu ein negatives Exziton-Couplet zeigt. Neben den gegensätzlichen Couplets bildeten die beiden ECD Spektren nahezu ein spiegelbildliches Verhältnis, was indiziert, dass es sich hier um diastereomere Homodimere mit unterschiedlicher axialer, aber identischer zentraler Chiralität handelt. Diese Formen von Atropisomeren sind sehr interessant für weitergehende Studien, da sie nicht nur strukturell von hohem Interesse sind, sondern auch aufgrund ihrer Aktivität gegen pathogene Bakterien, einschließlich breiter antibakterieller Aktivität gegen multi-resistente klinische Isolate pathogener Bakterien wie Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa. Nennenswert ist weiterhin, dass die Verbindungen im Test gegen eukaryotische THP-1 (leukämische Zelllinie) und BALB Zellen (murine embryonische Fibroblasten) mit IC50 Werten für beide Zelllinien von >32 µg/ml keine Aktivität zeigten, was besagt, dass Flavomannine und Talaromannine Spezifität für Prokaryoten im getesteten Konzentrationsbereich zeigen und somit mutmaßliche neue Ansatzpunkte für die Entwicklung neuer antibakterieller Arzneistoffe darstellen. Für Orientierungsstudien zum Wirkmechanismus der Flavomannine und Talaromannine wurde B. subtilis als Modelorganismus ausgewählt und Reportergen Assays wurden mit B. subtilis Stämmen durchgeführt, die das Leuchtkäfer Luciferase- oder β-Galactosidase Reportergen gebunden an sechs verschiedene Antibiotika-induzierbare Promotoren tragen. Ein Ansprechen auf die Biomarker yorB, helD, bmrC, liaI and recA in Gegenwart von steigenden Konzentrationen an Flavomannin A-D (1-4) und Talaromannin A (5) und B (6) wurde registriert. Flavomannin B, D, und Talaromannin B induzierten besonders die yorB und recA Promotoren. Flavomannin B zeigte die stärkste Induktion, gefolgt von Flavomannin D und Talaromannin B in abfallender Reihenfolge. Im Weiteren führte eine Analyse des Effektes von Flavomannin B (2) auf die Zell Morphologie und die chromosomale Organisation von B. subtilis 168 trpC2 zu einer Filamentation von B. subtilis, was auf eine Hemmung der Zellteilung und Defekte in der Nucleosid-Segregation hindeutet. In Kapitel drei werden Biemodin und drei neue Wortmanninderivate Wortmannin B, C und D, wobei von letzteren beiden bereits synthetische Verbindungen existieren, beschrieben, die zusammen mit den sieben bekannten Verbindungen Wortmannin A, Wortmin, Skyrin, Oxyskyrin, Emodinsäure, Rugulosin A und B isoliert wurden. Ihre Strukturen wurden auf der Grundlage der NMR-spektroskopischen Methoden einschließlich 1D (1H, 13C und DEPT) und 2D (COSY, HMQC, HMBC und ROESY) und Massenspektrometrie-Daten (ESI und HRESI-MS) aufgeklärt. Die axiale Chiralität von Biemodin wurde durch CD-Spektroskopie bestimmt. In einem Bioaktivitätsassay gegen pathogene Bakterienstämme zeigten nur Biemodin, Skyrin und Rugulosin A, vor allem gegen gram-positive Bakterien mit MHK-Werten zwischen 4 und 16 g /mL. In Kapitel vier sind zwei weitere interessante Verbindungen aus T. wortmanni aufgeführt: Talaromin A und B. Es handelt sich um zyklische Peptide, die aus jeweils sechs Aminosäuren und einer peptidisch gebundenen Anthranilsäure bestehen. Die absolute Konfiguration der Aminosäuren wurde mittels der Methode nach Marfey bestimmt. Talaromin A unterscheidet sich nur von Talaromin B durch einen Austausch von D-Val gegen D-Ile. Auch wenn bisher keine biologischen Aktivitäten für beide Peptide verzeichnet wurden, nachdem sie sowohl gegen pathogene Bakterien wie auch gegen murine Lymphomzellen (L5178Y) getestet wurden, sind beide dennoch interessant für weitere Bioaktivitätsstudien. In Kapitel fünf werden eine umfassende Übersicht und Zukunftsperspektiven dargestellt, wie man die Produktion von sekundären Metaboliten Verbindungen erhöhen und „stille“ Biosynthesewege innerhalb der zu untersuchenden Pilze induzieren kann. Dies kann durch die Zugabe von „epigenetic modifiers“, Co-Kultivierung von mehreren endophytischen Pilzen miteinander oder mit Bakterien oder auch durch Verwendung verschiedener Nährmedien erreicht werden. Summary Mutualistic associations between host plants and their particular endosymbionts were found to confer a variety of benefits to both partners, such as, the production of bioactive secondary metabolites by the microbial partner which is involved in host plant protection against insects and parasites thereby representing an acquired chemical defense mechanism of the host. However, endophytic microorganisms represent not only a vast reservoir of novel natural products involved in chemical ecology but offer also opportunities for exploitation in medicine, agriculture and industry. In chapter two, six new bisdihydroantracene atropisomers are described. Five of them are new natural products named as flavomannins B-D (2-4) and talaromannins A (5) and B (6), together with a known compound flavomannin A (1). Their structures were determined on the basis of spectroscopic methods including 1D (1H, 13C and DEPT) and 2D (COSY, HMQC, HMBC, ROESY) NMR experiments and by mass spectroscopic measurements data. The absolute stereochemistry of Flavomannin A (1) and B (2) was studied by solution ECD measurements. The ECD spectrum of Flavomannin A (1) was dominated by a positive exciton couplet centered around 277 nm, while Flavomannin B (2) showed the other way around as it recorded as a negative exciton couplet. Besides these opposite couplets, their ECD spectra showed also near mirror image relationship suggesting that they are diastereomeric homodimers with different axial chirality and identical central chirality. These types of atropisomers are really interesting for further studies since they have not only interesting type of structures but also their activity against pathogenic bacteria, including broad-spectrum antibacterial activity against multi-resistant clinical isolates of pathogenic bacteria including Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa, Noteworthy, the compounds showed no activity when tested against eukaryotic THP-1 cells (leukemia cell line) and BALB cells (mouse embryonic fibroblasts), with IC50 value for both cell lines was >32 µg/ml, indicating that the flavomannins and talaromannins displayed specificity for prokaryotes in the concentration range tested, making those putative new starting points for antibacterial drug development. For orienting studies on the mode of action of the flavomannins and talaromannins, B. subtilis was chosen as a model organism, reporter gene assays were performed using B. subtilis strains that carry the firefly luciferase or β-galactosidase reporter gene fused to six different antibiotic-inducible promoters. Response of the biomarkers yorB, helD, bmrC, liaI and recA in the presence of increasing concentrations of flavomannin A-D (1-4) and talaromannin A (5) and B (6). Flavomannin B, D and talaromannin B specifically induced the yorB and the recA promotor. Flavomannin B showed the strongest induction, followed by flavomannin D and talaromannin B in decreasing order. Furthermore, analysis of an effect of flavomannin B (2) on the cell morphology and chromosomal organization of B. subtilis 168 trpC2 resulted in filamentation of B. subtilis, indicating cell division inhibition and defects in nucleoid segregation. In chapter three, one atropisomer named biemodin and three wortmannin derivatives, including one new wortmannin B and two new as natural product, in addition to eight known compounds including wortmannin A, wortmin, skyrin, oxyskyrin, emodic acid, rugulosin A and B. Their structures were determined on the basis of NMR spectroscopic methods including 1D (1H, 13C and DEPT) and 2D (COSY, HMQC, HMBC and ROESY) and by mass spectrometry data (ESI and HRESI-MS). The axial chirality of biemodin was determined by CD experiment. When tested against pathogenic bacteria, only biemodin, skyrin and rugulosin A showed strong inhibition, especially against gram positive bacteria with MIC values ranging between 4 and 16 µg/mL. In chapter four, other interesting isolated compound from T. wortmanni are 2 cyclic peptides named Talaromin A and B. The absolute of their amino acids content within the peptides were determined by using Marfrey’s Methods. Both compounds were cyclic peptides containing a ring system with 6 amino acids linked to anthranilic acid. In chapter four, two other compounds from T. wortmanni which are two cyclic peptides named Talaromarin A and B containing six amino acids are presented. The absolute configuration of their amino acids was determined by using Marfrey’s Methods. Both compounds are cyclic peptides containing a ring system with 6 amino acids linked to anthranilic acid. The only difference of both peptides is the exchange of D-Val in one compound for D-Ile in the second peptide. Even though no biological activities have been recorded so far for both peptides after they have been tested against pathogenic bacteria as well as against the mouse lymphoma cell line (L5178Y), both represent new structures and are still interesting for further studies. In chapter five, a comprehensive overview and a future prospect on enhancing the production of secondary metabolites compounds and inducing silent biosynthetic pathways within the investigated fungi were explained. This can be achieved by adding epigenetic modifier compounds, co-cultivation between endophytic fungi or/and with bacteria as well as utilizing different diets.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Pharmazie » Pharmazeutische Biologie und Biotechnologie
Dokument erstellt am:	08.01.2013
Dateien geändert am:	08.01.2013
Promotionsantrag am:	20.11.2012
Datum der Promotion:	19.12.2012