Dokument: The Haemolysin A Type 1 Secretion System of Escherichia coli - Characterization and Biotechnological Application
| Titel: | The Haemolysin A Type 1 Secretion System of Escherichia coli - Characterization and Biotechnological Application | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=23241 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20121205-104952-4 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Deutsch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | B. Sc. Schwarz, Christian [Autor] | |||||||
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| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik » 540 Chemie | |||||||
| Beschreibungen: | Haemolysin A (HlyA) ist ein maßgeblicher Virulenzfaktor uropathogener E. coli Stämme, die schwere Erkrankungen in Menschen hervorrufen. Das Toxin wird von den Bakterien mit einem Typ 1 Sekretionssystem (T1SS) in die Umgebung sezerniert, wo es Wirtszellen lysiert. Drei Membranproteine bilden den T1SS Komplex, der den einstufigen Transport über die gesamte Gram-negative Zellhülle bewerkstelligt. TolC befindet sich in der äußeren Membran und bildet dort eine Pore, die von einem Membranfusionsprotein (Haemolysin D, HlyD) mit dem ABC Transporter Haemolysin B (HlyB) in der inneren Membran verbunden wird. Obwohl viele Details über den Mechanismus der Sezernierung bekannt sind, bleiben wichtige Fragen bislang unbeantwortet. Beispielsweise ist die Funktion einer N-terminalen Domäne von HlyB unbekannt, die circa 20% der gesamten Primärsequenz ausmacht. Diese Domäne, die C39 peptidase-like domain (CLD), wurde im Rahmen dieser Doktorarbeit strukturell und biochemisch charakterisiert. Die erzielten Ergebnisse gewähren Einblicke in die essentielle Funktion der CLD für die Sezernierung von HlyA. Die CLD interagiert mit der RTX Domäne von HlyA und schützt so vermutlich dessen ungefalteten, sezernierbaren Zustand innerhalb der Zelle vor Aggregation und/oder proteolytischem Abbau.
Das HlyA T1SS wurde außerdem auf dessen Eignung zur Produktion von Proteinen hin untersucht. Zahlreiche Proteine wurden jedoch schlecht oder gar nicht sezerniert. In dieser Doktorarbeit wird eine Erklärung für die fehlgeschlagenen Produktionsversuche geliefert. Demnach korrelieren die Sezernierungseffizienzen umgekehrt mit der Faltungsgeschwindigkeit der zu transportierenden Proteine. Außerdem konnte ein ursprünglich nicht-sezerniertes Protein durch die Insertion einer spezifischen Mutation, die zu einer Reduktion der Faltungsgeschwindigkeit führt, in guten Ausbeuten und in einem funktionalen Zustand sezerniert werden. Trotz dieses "slow-folding" Konzepts ist die Nutzung des HlyA T1SS für die Proteinproduktion stark eingeschränkt, da viele Protein zu schnell falten. Im Rahmen dieser Doktorarbeit konnte nun das Sekretionssystem optimiert werden. Dabei gelang die Entwicklung eines universellen Sekretionssystems, das bislang die Produktion jedes Proteins in einem funktionalen Zustand ermöglicht. Die entwickelte Technologie stellt zugleich das erste biotechnologische Verfahren zur Herstellung beliebiger Peptide dar.Haemolysin A (HlyA) is a major virulence factor of uropathogenic Escherichia coli (E. coli) strains that cause severe diseases in humans. The toxin is transported by a dedicated Type 1 secretion system (T1SS) from the bacterial cytoplasm to the surrounding, where it lyses host cells. Three membrane proteins assemble the HlyA T1SS secretion complex and are essential to catalyze the one-step transport of the 110 kDa HlyA across the Gram-negative cell envelope. TolC persists in the outer membrane and represents a pore for the passage of HlyA. The membrane fusion protein HlyD bridges TolC to the ABC transporter HlyB at the inner membrane. Although important insights into the coordinated secretion process were gained in the last decades, many questions remained unanswered. For example, an N-terminal domain of HlyB represents about 20 % of the primary sequence, however, its function was unknown. As part of this doctoral research, this C39 peptidase-like domain (CLD) was characterized in great detail by structural and biochemical approaches. These studies revealed the pivotal function of the CLD in the secretion process. It interacts with the RTX domain of unfolded HlyA to protect the secretion-competent state from being aggregated and/or degraded. The HlyA T1SS has also been analyzed for its applicability as production platform for proteins. Unfortunately, many proteins were secreted barely or not at all. This doctoral research provides an explanation for this failure and demonstrates that the secretion efficiency of proteins correlates inversely with the folding velocity of the passenger protein. Moreover, non-secreted passenger proteins could be secreted after the introduction of slow-folding mutations and the secreted protein was shown to be functional. Despite this "slow-folding concept", the requirement of slow-folding proteins hampers the industrial application of the HlyA T1SS as production platform. Therefore, another focus of this doctoral research was the improvement of the secretion system to circumvent this limitation. A new secretion system could be established that enables the secretion of all proteins tested so far with good yields and in a functional form. Importantly, the optimized system also represents the first recombinant system for the production of peptides. | |||||||
| Lizenz: |  Urheberrechtsschutz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Chemie » Biochemie | |||||||
| Dokument erstellt am: | 05.12.2012 | |||||||
| Dateien geändert am: | 05.12.2012 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 03.03.2012 | |||||||
| Datum der Promotion: | 26.10.2012 |
