Dokument: The role of a peroxisomal NAD+ carrier in plants

Titel:	The role of a peroxisomal NAD+ carrier in plants
Weiterer Titel:	Die Rolle eines peroxisomalen NAD+ Transporters in Pflanzen
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=23179
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20121121-111606-2
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Bernhardt, Kristin [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 5,58 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 20.11.2012 / geändert 20.11.2012
Beitragende:	Prof. Dr. Weber, Andreas P. M. [Betreuer/Doktorvater] Prof. Dr. Simon, Rüdiger [Gutachter]
Stichwörter:	Peroxisome NAD Plant Transporter
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	NAD+ is an essential cofactor for several metabolic processes. In plants, the NAD+ biosynthesis takes exclusively place in the cytosol (Noctor et al., 2006; Hashida et al., 2009) whereas NAD+-dependent enzymes are located in the cytosol and other cell compartments, including peroxisomes. Earlier evidences assume that the peroxisomal membrane is impermeable for “bulky” cofactors like NAD+ and CoA (Donaldson, 1981; Antonenkov and Hiltunen, 2012). However, the fact that peroxisomal metabolism require theses molecules (e.g. for fatty acid β-oxidation, photorespiration, and H2O2 detoxification; Hu et al., 2012) necessitates the need for a NAD+ import. For decades, the existence of such a peroxisomal NAD+ transport protein was controversially discussed. In this thesis, the first peroxisomal NAD+ carrier, named PXN, was characterized in the model plant Arabidopsis thaliana. The carrier encoded by the gene At2g39970 is a member of the mitochondrial carrier family (MCF) and closely related in sequence to peroxisomal, chloroplastic, and mitochondrial ATP and NAD+ transporters from Arabidopsis, yeast, and human. Interaction studies confirmed that PXN is targeted to peroxisomes via interaction with PEX19 that is known to act as chaperone for PMP targeting (Jones et al., 2004; Van Ael and Fransen, 2006). Performing uptake assays, it was demonstrated that recombinant PXN protein catalyzed the transport of NAD+ and CoA in exchange with AMP, which was recently confirmed by Agrimi et al. (2012b). Furthermore, cell-free expressed PXN protein mediated the exchange of NAD+ with NADH and acts thereby as reduction/oxidation (redox) shuttle. The NADH transport activity is unique compared to the other known MCF-type NAD+ transporter from Arabidopsis, yeast, and human. This thesis indicated first evidences that the PXN activity is positively regulated via phosphorylation. The phosphorylation site at serine 155 was detected in two independent phosphoproteomic studies (Eubel et al., 2008; Ito et al., 2009). Here, it was in addition shown that the phosphorylation site at S155 and the unique loop region of the PXN protein did not influence the PEX19-dependent peroxisomal targeting, indicating that the PEX19 binding site is not located at the loop region. Three independent Arabidopsis pxn T-DNA insertion lines illustrated the requirement of peroxisomal NAD+ and CoA supply mediated by PXN for optimal fatty acid β-oxidation. pxn seedlings were delayed in breakdown of fatty acids released from storage oil, which was visualized by higher levels of storage fatty acids and the retention of oil bodies. However, germination was not impaired in plants deficient in PXN. The pxn β-oxidation phenotype correlated with the increased PXN expression during β-oxidation-dependent seedling establishment and the PXN co-expression with proteins involved in β-oxidation. Furthermore, the link between PXN function and the β-oxidation-dependent processes (e.g. mobilization of storage oil and biosynthesis of phytohormones) was exhibited by the expression pattern using PXN promoter-GUS studies in stable transformed Arabidopsis seedlings. A redundant system for PXN was predicted, because pxn mutants exhibited an impaired but not complete block of β-oxidation, as expected for plants lacking the NAD+ and CoA supply via PXN. Two redundant systems were assumed. (i) The NAD+/AMP shuttle could be taken over by the peroxisomal adenine nucleotide carriers PNC1 and PNC2 when PXN is absent, because both transport substrates, ATP and NAD+, are similar in structure. To address this, mutant lines repressing both pnc genes and pxn were generated by using a small interfering RNA approach. The obtained transgenic plants needs to be investigated in the future. (ii) The NAD+/NADH exchange function of PXN could be redundant to the malate/oxaloacetate (malate/OAA) shuttle that transfers reducing equivalents across the peroxisomal membrane (Pracharoenwattana et al., 2007). Furthermore, the peroxisomal hydroxypyruvate reductase 1 (HPR1) is proposed to play a role in regeneration NAD+ for β-oxidation and thus also functions as redox shuttle during early seedling growth (Pracharoenwattana et al., 2010). To test this hypothesis, different Arabidopsis plants were generated in this work by crossing the pxn lines with the mutant defective in both pMDHs and HPR1 and by repressing the PXN expression using an PXN specific artificial microRNA in the pmdh and hpr1 mutant lines. However, the resulted transgenic plants need to be further investigated regarding the impact on β-oxidation for storage oil mobilization. In silico analysis revealed that PXN is co-expressed with the ascorbate peroxidase (APX) and the NADH-dependent monodehydroascorbate reductase (MDAR), which are required for H2O2 detoxification (Graham, 2008). PXN expression is altered during oxidative stress, when H2O2 accumulated inside the cells. This implicated a role of PXN in supplying NAD+ for peroxisomal H2O2 detoxification via the APX/MDAR system. This hypothesis has to be verified by examining pxn mutants under oxidative stress conditions. In sum, this thesis described the characterization and the function of a peroxisomal NAD+ and CoA carrier during seedling establishment and oxidative stress. Site-directed mutagenesis of the PXN protein revealed that the transport activity is regulated by phosphorylation. Regarding the PMP import, it was demonstrated that the PEX19 receptor is involved in the peroxisomal targeting of PXN and several other PMPs. NAD+ ist ein essentieller Cofaktor für viele metabolische Prozesse und dessen Biosynthese findet ausschließlich im Zytosol statt (Noctor et al., 2006; Hashida et al., 2009). Eine subzelluläre Verteilung von NAD+ muss gewährleistet sein da NAD+-abhängige Enzyme nicht nur im Zytosol, sondern auch in den anderen Zellkompartimenten, wie z.B. den Peroxisomen lokalisiert sind. Da die Membranen der Organellen impermeabel für NAD+ sind, ist die Notwendigkeit eines NAD+-Transportsystems unabkömmlich. Die Existenz eines peroxisomalen NAD+-Transporters wurde über Jahrzehnte kontrovers diskutiert (Donaldson, 1981; Antonenkov and Hiltunen, 2012). Zu Beginn dieser Arbeit war nicht geklärt wie die NAD+-abhängigen Prozesse, wie z.B. β-Oxidation, Photorespiration und H2O2 Abbau (Hu et al., 2012) mit dem Cofaktor in den Peroxisomen versorgt werden. In dieser Arbeit wurde erstmals ein peroxisomaler NAD+-Transporter aus der Modellpflanze Arabidopsis thaliana charakterisiert, der als peroxisomal NAD+ carrier (PXN) bezeichnet wurde. Dieses Transportprotein, das durch das Gen At2g39970 kodiert wird, gehört als Mitglied der mitochondrialen Transportfamilie (mitochondrial carrier family; MCF) zur Gruppe der bereits bekannten peroxisomalen, mitochondrialen und chloroplastidären ATP- und NAD+-Transportern aus der Pflanze, Hefe und des Menschen an. Mit Hilfe von Protein-Interaktionsstudien konnte gezeigt werden, dass PXN mit dem Peroxin PEX19 interagiert, einem Hilfsprotein das peroxisomale Membranproteine zu den Peroxisomes geleitet (Jones et al., 2004; Van Ael and Fransen, 2006). Durch NAD+-Aufnahmemessungen an Liposomen konnte demonstriert werden, dass das rekombinante PXN-Protein den Transport von NAD+ im Austausch mit AMP katalysiert. Zudem konnte gezeigt werden, dass ebenfalls CoA und NADH als Substrat für PXN fungieren. Gezielte Mutationen im PXN–Protein zeigten, dass die Transportaktivität über eine Phosphorylierung am Serin 155 reguliert wird, die durch zwei unabhängige Phosphoproteomic-Studien als Phosphorylierungsstelle verifiziert wurde (Eubel et al., 2008; Ito et al., 2009). In dieser Arbeit konnte darüber hinaus bestätigt werden, dass der Phosphorylierungszustand von S155 und die einzigartige Loop-Region von PXN keinen Einfluss auf das peroxisomale Targeting und die Bindung an PEX19 haben. Drei unabhängige Arabidopsis T-DNA-Insertionslinien für das pxn-Gen zeigten, dass PXN für einen optimalen Ablauf der β-Oxidation notwendig ist. In diesen Mutanten ist der oxidative Abbau von Fettsäuren mittels der β-Oxidation während der Speicherlipid-Mobilisierung verzögert. Dies wurde durch die erhöhten Mengen an Speicherfettsäuren und an dem Verbleiben von Ölkörpern in den Mutanten-Keimlingen verifiziert. Der β-Oxidationsphänotyp von pxn-Keimlingen korreliert mit der erhöhten PXN-Expression während β-Oxidation-abhängiger Keimlingsentwicklung. Des Weiterem sind β-Oxidation-spezifische Gene mit PXN co-exprimiert. Durch PXN Promotor-GUS Studien von stabil transformierten Arabidopsis-Keimlingen konnte der Zusammenhang zwischen PXN und der β-Oxidation während des Abbaus von Speicherlipiden und der Biosynthese von Pflanzenhormonen unterstützt werden. Auf Grund des schwachen β-Oxidationsphänotyps von pxn-Keimlingen wurde die Existenz eines redundanten Systems angenommen, da in Abwesenheit von PXN eine vollständige Blockierung der β-Oxidation erwartet wurde. Es wurden daher die folgenden redundante Systeme angenommen: (i) Die NAD+/AMP-Funktion von PXN könnte durch die peroxisomalen ATP Transportproteine PNC1 und PNC2 übernommen werden, da ATP und NAD+ eine ähnlichen Molekülstruktur aufweisen. Um dies zu testen, wurden Dreifachmutanten hergestellt, die in der Expression von PXN, PNC1 und PNC2 defekt sind. Zukünftige Analysen werden zeigen, ob der Defekt von PXN durch die PNCs aufgehoben werden kann. (ii) Im Fall dass PXN einen NAD+/NADH-Austausch katalysiert, ist diese Transportfunktion zu dem peroxisomalen Malat/Oxalacetat-Shuttle redundant (Pracharoenwattana et al., 2007). Darüberhinaus konnte kürzlich gezeigt werden, dass die peroxisomale Hydroxypyruvatreduktase 1 (HPR1) NAD+ während der β-Oxidation regeneriert und somit ebenfalls als Redox-Shuttle fungiert (Pracharoenwattana et al., 2010). In dieser Arbeit wurden Arabidopsis-Mutanten erzeugt, bei denen PXN, die beiden peroxisomalen MDHs sowie die HPR1 ausgeschaltet werden. Eine detailierte Untersuchung der Mutanten bezüglich der Speicherlipid-Mobilisierung steht noch aus. In silico Analysen konnten zeigen, dass PXN mit der Ascorbatperoxidase (APX) und der NAD+-abhängigen Monodehydroascorbatreduktase (MDAR) co-exprimiert ist. Diese beiden Enzyme sind für den Abbau von giftigen H2O2 in den Peroxisomen beteiligt (Graham, 2008). Zudem ist die Expression von PXN während oxidativen Stresses verändert, bei dem H2O2 in der Zelle akkumuliert. Um zu zeigen, dass der PXN für den Abbau von H2O2 mittels des APX/MDAR systems zuständig ist, sollten physiologische Experimente unter verschiedenen oxidativen Stressbedingungen mit Hilfe der pxn Mutanten durchgeführt werden. Zusammenfassend beschreibt diese Arbeit die Charakterisierung und den Einfluss von PXN als einen peroxisomalen NAD+- und CoA-Transporter während der Speicherlipid-Mobilisierung und oxidativen Stress. Darüber hinaus konnten erste Hinweise auf eine Regulation der PXN Transportaktivität über Phosphorylierung gezeigt werden. Zusätzlich wurde demonstriert, dass PXN und andere peroxisomale Membranproteine über eine Interaktion mit PEX19 zu der peroxisomalen Membran transportiert werden.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » Biochemie der Pflanzen
Dokument erstellt am:	21.11.2012
Dateien geändert am:	21.11.2012
Promotionsantrag am:	10.09.2012
Datum der Promotion:	17.10.2012