Dokument: Characterization of growth and differentiation of a spontaneously immortalized keratinocyte cell line (HaCaT) in a defined, serum-free culture system

Titel:	Characterization of growth and differentiation of a spontaneously immortalized keratinocyte cell line (HaCaT) in a defined, serum-free culture system
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=2315
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20010713-000315-9
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Rekus, Martin T. [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 947,5 KB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 09.02.2007 / geändert 09.02.2007
Beitragende:	Prof. Dr. Dr. h.c. Ruzicka, Thomas [Gutachter] Prof. Dr. Heinz, Hans-Peter [Gutachter] Prof.Dr. Kemperdick [Gutachter]
Stichwörter:	HaCaT, Keratinozyten, serumfreie Zellkultur, Differenzierung, Proliferation, Wachstumsfaktoren, Keratine, Tumor-Promotor 12-o-tetradecanoyl-13-acetat (TPA), dominant-negatives c-jun Deletionskonstrukt TAM-67, AP-1HaCaT, keratinocytes, serum-free culture, differentiation, proliferation, growth factors, keratins, tumor-promoting phorbol ester TPA, dominant-negative c-jun mutant TAM-67, AP-1
Dewey Dezimal-Klassifikation:	600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften » 610 Medizin und Gesundheit
Beschreibungen:	HaCaT Zellen sind humane, spontan immortalisierte Keratinozyten, die bisher nur in serumhaltigem Medium kultiviert und charakterisiert wurden. In dieser Arbeit ist es gelungen, HaCaT Zellen in serumfreiem MCDB 153-Medium mit Zusätzen zu etablieren. HaCaT Zellen wurden hinsichtlich Proliferations- und Differenzierungskriterien analysiert und mit Normalen Humanen Keratinozyten (NHK) verglichen. Die Methoden Zellzahlbestimmung, Durchflußzytometrie, klonaler Wachstumsassay, Bromodeoxyuridine (BrdU)-Inkorporation, Apoptoseassay, Northernblot- Analyse, metabolische Markierung und Transfektion wurden hierzu in drei verschiedenen Projekten eingesetzt. Im Kompletten Medium (KM) mit epidermalem Wachstumsfaktor (EGF), Insulin und bovinem Hypophysenextrakt betrug die Zellgenerationszeit 26 Stunden. 90% aller Zellen befanden sich im Wachstumspool, wie durch Langzeit-BrdU-Markierung gezeigt werden konnte. Nach Entzug der exogenen Wachstumsfaktoren (WF) betrug die Zellgenerationszeit 40 Stunden, das Wachstum der Zellen ging schnell zurück und es entstanden Zellen mit apoptotischen Merkmalen. Nach 9 Tagen ohne WF befanden sich weniger als 5% der Zellen in der S-Phase des Zell-zyklus. Durch Zusatz von EGF oder Insulin wurde das Wachstum ähnlich wie durch KM stimuliert. Eine Erhöhung der Kalziumkonzentration auf 1.5 mM im Kulturmedium (mit oder ohne exogene WF) hatte keinen Einfluß auf das Wachstumsverhalten, führte jedoch zu einer erhöhten Adhäsion der Zellen. Im Gegensatz zu NHK exprimierten HaCaT Zellen im Kulturmedium ohne exogene WF die frühen Differenzierungsmarker Keratin 1 (K1), Keratin 10 (K10) und Involucrin. Ein großer Teil dieser Zellen verlor die Eigenschaft, Zellklone zu bilden und leitete somit die terminale Differenzierung bereits unter subkonfluenten Wachstumsbedingungen ein. EGF supprimierte die K1, K10 und Involucrin mRNA-Expression in subkonfluenten und konfluenten Zellkulturen. Bei Erhöhung der Kalziumkonzentration auf 1.5 mM exprimierten HaCaT Zellen K1 in subkonfluenten und konfluenten Zellkulturen in KM. Aus diesen Ergebnissen kann geschlossen werden, daß HaCaT Zellen in serumfreiem Medium kultiviert werden können, wobei sie viele Wachstums- und Differenzierungseigenschaften von NHK beibehalten. Allerdings sind HaCaT Zellen im Vergleich zu NHK stärker von Wachstumsfaktoren abhängig, denn deren Entzug resultiert in einem Wachstumsrückgang, der Expression von Differenzierungsmarkern und dem Auftreten von apoptotischen Zellen. HaCaT Zellen sind immortalisierte Zellen. Dadurch werden sie im Sinne der In-Vitro-Mehrstadien-Tumorgenese im Initiationsstadium eingestuft. Die Auswirkung des Tumor-Promotors 12-o-tetradecanoyl-13-acetat (TPA) auf Wachstum und Differenzierung von HaCaT Zellen wurde im weiteren untersucht. Im Gegensatz zum zellwachstumsinhibierenden Effekt auf NHK hatte TPA keinen Einfluß auf die Zellgenerationszeit und den BrdU- Markierungsindex von HaCaT Zellen. Allerdings erhöhte TPA das klonale Wachstumspotential von HaCaT Zellen in KM. TPA konnte das Wachstum von HaCaT Zellen im Kulturmedium ohne exogene WF nicht steigern, jedoch erhöhte es auch hier das klonale Wachstumspotential. Somit konnten zumindest einige HaCaT Zellen auch nach dem Entzug von WF ihr proliferatives Potential erhalten. TPA supprimierte darüber hinaus die mRNA-Expression von K1, K10 und Involucrin im Kulturmedium ohne WF. Diese Ergebnisse zeigen, daß sich HaCaT Zellen von NHK durch ihr Ansprechverhalten auf TPA unterscheiden. TPA hatte auf HaCaT Zellen keinen zellwachstumsinhibierenden Effekt und verhinderte die Einleitung der terminalen Differenzierung in einigen HaCaT Zellen. jun und fos aus der Activator Protein 1 (AP-1) Familie der Transkriptionsfaktoren regulieren Gene, die während des Wachstums, der Differenzierung und der Tumor-Progression exprimiert werden. HaCaT Zellen wurden mit einem dominant-negativen Deletionskonstrukt von c-jun (Transactivation domain mutant 67 (TAM 67)) transfiziert. Diese Zellreihe wurde pmm 67 HaCaT genannt. Als Kontrollzellreihe dienten HaCaT Zellen, die mit dem neo-Vektor transfiziert wurden (neo HaCaT). Die TAM 67-Proteinexpression wurde durch metabolische Markierung nachgewiesen. Viele der Wachstums- und Differenzierungs-kriterien der pmm 67 HaCaT Zellreihe waren mit denen der Kontroll-zellreihe neo HaCaT vergleichbar. Allerdings konnte TPA die mRNA-Expression von K1 und K10 in der pmm 67 HaCaT Zellreihe im Vergleich zur neo HaCaT Zellreihe bei Subkonfluenz nicht unterdrücken. Diese Ergebnisse deuten an, daß c-jun wahrscheinlich nicht an der Wachstumsregulation, sowie der K1- und K10-Expression in HaCaT Zellen beteiligt ist. Wahrscheinlich spielt jedoch c-jun in der TPA-mediierten Suppression der K1- und K10-Expression in subkonfluenten HaCaT Zellkulturen eine wichtige Rolle. HaCaT, a human spontaneously immortalized keratinocyte cell line, is routinely cultured in serum-containing medium. This study established in vitro culture of HaCaT cells in serum-free medium containing MCDB 153 with supplements. Growth and differentiation characteristics were analyzed by cell enumeration, clonal growth assays, flow cytometry, bromodeoxyuridine (BrdU) incorporation, an apoptosis assay and Northern blot techniques and compared to those of normal human keratinocytes (NHK) which are also routinely cultured in this culture medium. In complete medium with epidermal growth factor (EGF),insulin and pituitary extract, the cell generation time was 26 hours. 90% of cells cycled as measured by steady state BrdU labeling. Initial removal of exogenous growth factors (GF) increased the cell cycle time to 40 hours. Subsequently proliferation decreased markedly and cells with a poptotic features developed. By 9 days of GF absence, S phase had decreased to < 5%. EGF or insulin restimulated proliferation similar to growth in complete medium. Elevation of calcium (1.5 mM) in culture medium containing or depleted of GF did not affect proliferation kinetics but increased adherence. In contrast to NHK, subconfluent HaCaT cells cultured without GF were induced to express the early differentiation transcripts keratin 1 (K 1), keratin 10 (K 10) as well as involucrin. The majority of these cells lost the ability to form clones and became committed to terminal differentiation already at subconfluence. EGF suppressed K 1, K 10 and involucrin mRNA expression in both rapidly growing and confluent cells. 1.5 mM calcium concentration induced expression of K 1 at confluence and subconfluence in complete medium. It may be concluded that HaCaT cells can be propagated in serum-free medium with preservation of several growth characteristics of NHK. However, proliferation and differentiation of HaCaT cells are more stringently dependent on exogenous GF, and GF depletion is associated with alterations in cell survival and induction of apoptosis. HaCaT are immortalized cells and thus are considered initiated in the context of in vitro multistage carcinogenesis. The tumor-promoting phorbol ester 12-o-tetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA) was used to determine HaCaT cell growth and differentiation responses which were assessed by cell enumeration, clonal growth assays, flow cytometry, BrdU incorporation and Northern blot techniques. TPA addition to complete medium did not significantly alter the generation time or decrease the labeling index of HaCaT cells in contrast to NHK. However, TPA increased clonal growth potential of HaCaT cells in complete medium. TPA failed to stimulate proliferation of HaCaT cells propagated in standard medium without exogenous GF but was sufficient to increase HaCaT cell clonal growth potential under these conditions. Thus at least some HaCaT cells retained proliferative potential under culture conditions favoring loss of clonogenicity and commitment to terminal differentiation. Concomitant with an increase in clonogenicity, TPA actively suppressed differentiated K 1 (similar to NHK),K 10 and involucrin mRNA expression at both, subconfluency and confluency. These findings demonstrate that TPA-mediated effects on HaCaT cell growth and differentiation contrast distinctly to those of NHK. In particular, HaCaT cells differ from NHK in lacking the growth-inhibitory and commitogenic response to TPA. These studies indicate that TPA protects HaCaT cells from commitogenic signals such as GF withdrawal. jun and fos of the AP-1 transcription factor family regulate genes expressed during proliferation, differentiation and tumor progression. Growth and differentiation characteristics were analyzed in HaCaT cells transfected with a dominant-negative c-jun, TAM 67 (cell line designated pmm 67 HaCaT), a deletion mutant lacking the transactivation domain but retaining DNA binding and dimerization domains and compared with cells transfected with neo (control cell line designated neo HaCaT). TAM 67 protein expression was confirmed by metabolic labeling. Proliferation kinetics and differentiated keratin 1 and keratin 10 expression were analyzed by cell enumeration and Northern Blot analysis. pmm 67 HaCaT proliferation and differentiation characteristics were largely similar to those of HaCaT cells transfected with neo. However, TPA failed to suppress K 1 and K 10 mRNA expression at subconfluency in growth factor-deficient medium of pmm 67 HaCaT compared to neo HaCaT. These studies provide evidence that c-jun may not be involved in HaCaT cell regulation of proliferation and differentiated keratin 1 and keratin 10 expression. However, c-jun is likely involved in TPA-mediated suppression of K 1 and K 10 expression of HaCaT cells at subconfluent cell densities. Serum-free cultivation represents an in vitro model for direct comparison of growth and differentiation of both immortalized HaCaT cells and NHK in which deletion or addition of certain chemicals can be performed easily and in a well-defined fashion. In this manner, the response of keratinocytes can be readily and more precisely monitored. These culture conditions should be useful for future studies comparing HaCaT cells and normal keratinocytes and elucidating the cellular-molecular mechanisms that control growth, differentiation as well as immortalization and later events in epidermal carcinogenesis.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Medizinische Fakultät
Dokument erstellt am:	13.07.2001
Dateien geändert am:	12.02.2007
Promotionsantrag am:	13.07.2001
Datum der Promotion:	13.07.2001