Dokument: Optimierung eines Expressionssystems für die Synthese von Redox- und Membranproteinen in Rhodobacter capsulatus
| Titel: | Optimierung eines Expressionssystems für die Synthese von Redox- und Membranproteinen in Rhodobacter capsulatus | |||||||
| Weiterer Titel: | Optimization of an expressionsystem for the synthesis of redox and membrane proteins in Rhodobacter capsulatus | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=23104 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20121108-120719-7 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Deutsch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Bergmann, René [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Prof. Dr. Jaeger, Karl-Erich [Gutachter] Prof. Dr. Groth, Georg [Gutachter] | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie | |||||||
| Beschreibungen: | Die Synthese von Proteinen mit Metall-Kofaktoren oder Membranproteinen mittels heterologer Expression ist in bakteriellen Expressionssystemen oft durch die physiologischen Eigenschaften der Expressions¬wirte limitiert. Um die Expression solcher Zielproteine dennoch zu ermöglichen, können Standartexpressionswirte, wie z.B. das Enterobakterium Escherichia coli genetisch modifiziert werden. In vielen Fällen stellt jedoch die Verwendung alternativer Expressionswirte grundsätzlich eine interessante Option dar. So scheinen z.B. phototrophe Bakterien, wie Rhodobacter capsulatus, aufgrund ihrer besonderen physiologischen Eigenschaften für die funktionelle Expression von Membranproteinen und Proteinen mit Metall-Kofaktor im besonderen Maße geeignet zu sein: Die phototrophe Anzucht von R. capsulatus geht mit der Ausbildung eines intracytoplasmatischen Membransystems (ICM) einher, wobei zudem effiziente Faltungs- und Integrationssysteme für Membranproteine zur Verfügung stehen. R. capsulatus generiert als phototropher und Stickstoff-fixierender Organismus außerdem eine Reihe von Redox-Kofaktoren, sodass auch die Synthese von Proteinen mit solchen Kofaktoren begünstigt ist. Im Rahmen der Arbeit wurde daher zunächst untersucht, inwieweit die Verwendung von LEDs, die ausschließlich im physiologisch relevanten Wellenlängenbereich Licht emittieren, die phototrophe Anzucht von R. capsulatus, sowie die Synthese der Photosynthesemembran und der Kofaktoren beeinflusst. Durch die Belichtung mit Infrarotdioden wurde zunächst ausschließlich das Bakteriochlorophyll des Photosystems angeregt, was zu verkürzten Generationszeiten, erhöhter Proteinbiosynthese und vermehrter Ausbildung von Metall¬-Kofaktoren führte. Bei der Verwendung von Blaulichtdioden (Anregung der Carotinoide des Photosystems), zeigte sich hingegen überraschend ein Phänotyp der vermutlich durch Lichtmangel induziert wird. Zunächst wurden bei diesen Lichtbedingungen das Wachstum und die Proteinbiosynthese beeinträchtigt. Darüber hinaus zeigte sich jedoch, dass R. capsulatus bei Blaulicht eine deutlich erhöhte Menge an Photopigmenten bildete, was ein Indikator für die erhöhte ICM-Synthese ist. Es ist dementsprechend möglich, bei der phototrophen Anzucht von R. capsulatus durch die Wahl der Lichtquellen physiologische Veränderungen herbeizuführen, die der funktionellen Synthese bestimmter Zielproteine, wie etwa Membranproteinen dienlich sind.
Zur näheren Charakterisierung der Licht-abhängigen Phänotpypen wurde eine Mutante von R. capulatus erzeugt, die das "photoactive yellow protein", dem einzigen bekannten Blaulichtrezeptor in R. capsulatus, nicht mehr ausbilden kann. Bei dem Vergleich des R. capsulatus Wildtyps mit der pyp-Mutante unter Infrarot- und Blaulichtbeleuchtung, konnte erstmals gezeigt werden, dass die Expression der Photosynthese- und Nitrogenasegene in Abhängigkeit von PYP reguliert ist. Weiterhin wurden die schon bestehenden R. capsulatus pRho-Expressionsvektoren so optimiert, dass sie für die Reinigung von Membranproteinen und Proteinen mit Metall-Kofaktoren besser geeignet sind. Dazu wurde zum einen der R. capsulatus Pnif Promotor in den Rhodobacter-Expressionsvektor kloniert. Dieser Promotor erlaubt die Koinduktion der heterolgen Genexpression mit der Ausbildung des ICM und der Eisen-Schwefel-Kofaktoren. Darüber hinaus wurde der His6 Affinitätstag durch den Strep II Affinitätstag ersetzt, um die Metallbindungseigenschaften rekombinanter Metalloproteine nicht zu beeinflussen. Die Expressionsstärke und Regulierbarkeit des Promotors Pnif wurden zunächst durch die Expression des Fluoreszenzreporters YFP getestet. Dabei konnte gezeigt werden, dass der Promotor Pnif durch Ammonium und überraschender Weise auch durch Blaulicht strikt inhibiert werden kann. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass sich die Expressionsstärke durch eine einfache Änderung der Strahlungsintensität im infraroten Bereich moduliert werden kann. Diese Expressionsvektoren wurden anschließend zur Überexpression des Ferredoxins FdII, einem Redoxprotein mit einem [3Fe-4S] und einem [4Fe-4S] Eisen-Schwefel Kofaktor in R. capsulatus eingesetzt. Es konnte gezeigt werden, dass R. capsulatus im Gegensatz zu E. coli in der Lage ist, dieses Protein mit den entsprechenden Metall-Kofaktoren zu synthetisieren.The synthesis of proteins which are carrying a metal-cofactor or are localized within the membrane is often limited because of unfavorable physiological properties of the expression hosts. Standard expression hosts like the enterobacterium Escherichia coli can genetically be modified, to enable expression of such proteins anyhow. In most cases the use of alternative expression hosts is in principle an interesting option. For example, phototrophic bacteria, such as Rhodobacter capsulatus, seem to be well suited for the functional expression of membrane proteins and proteins with metal-cofactors, due to their special physiological properties. Phototrophic growth of R. capsulatus leads to the formation of an intracytoplasmic membrane system, whereat an efficient folding and integration system for membrane proteins is provided. R. capsulatus generates as phototrophic and nitrogen fixing organism a variety of redox cofactors, so that the organism is also well suited for the synthesis of redox proteins. Within this work the use of LEDs, which only emit light at the physiological relevant wavelengths, in photosynthetic growth of R. capsulatus was studied, as well as their influence on the generation of photosynthetic membrane and metal-cofactors. By using infrared light diodes only bacteriochlorophyll was excited leading to shorter generation times, a higher level of protein biosynthesis and enhanced metal-cofactor synthesis. Under illumination with blue light diodes (excitation of carotenoids) R. capsulatus showed a surprising phenotype, which was probably due to concomitant low-light conditions, in which cell growth and protein biosynthesis were impaired due to low photosynthesis efficiency. However, under these conditions R. capsulatus showed higher quantities of photopigments, which indicates increased ICM-synthesis. Thus, the use of different light sources allows to control certain physiological characteristics which are helpful for the functional expression of "difficult-to-express" proteins, as membrane and redox proteins, during phototrophic growth of R. capsulatus. For a closer characterization of the light dependent phenotypes a mutant was generated, which is not able to express the photoactive yellow protein (PYP), which is the only known blue-light receptor in R. capsulatus. In comparision of the R. capsulatus Wildtyp to the pyp-mutant under infrared and bluelight illumination for the first time it could be shown that the expression of photosynthesis and nitrogenase genes is regulated by PYP. Furthermore, the existing R. capsulatus pRho expression vectors were optimized in order to be better applicable for the expression and purification of membrane proteins and proteins with metal-cofactors. For that purpose, the R. capsulatus Pnif promoter was cloned into the Rhodobacter expression vector. This promoter allows coinduction of heterologous target gene expression and formation of the ICM as well as metal-cofactors. In addition, the His6-affinity tag was substituted by the Strep II affinity tag, to avoid any impairment which might occur due to the metal binding properties of the His6 tag.. The level of expression and the regulation of the Pnif promoter were tested using the fluorescence reporter YFP. It could be shown that the promoter Pnif is strictly repressed by ammonium sulfate and surprisingly also by blue light. Furthermore, I demonstrated that the level of Pnif-dependent expression can be modulated by simple alterations in the intensity of infrared radiation. The novel expression vectors were finaly used for the expression of the ferredoxin FdII, which is a redox protein harbouring a [3Fe-4S] and a [4Fe-4S] iron-sulfur cofactor. It could be shown, that in contrast to E. coli R. capsulatus is capable of synthesizing the FdII protein with the correct metal cofactors. | |||||||
| Lizenz: |  Urheberrechtsschutz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » Enzymtechnologie | |||||||
| Dokument erstellt am: | 08.11.2012 | |||||||
| Dateien geändert am: | 08.11.2012 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 12.05.2011 | |||||||
| Datum der Promotion: | 14.11.2011 |
