Dokument: Zellbiologische Untersuchung der Regulatoren der Rho-GTPasen

Titel:	Zellbiologische Untersuchung der Regulatoren der Rho-GTPasen
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=2275
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20030514-000275-2
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Herbrand, Ulrike [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 7,48 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 09.02.2007 / geändert 09.02.2007
Beitragende:	Prof. Dr. Knust, Elisabeth [Gutachter] Prof. Dr. Ernst, Joachim F. [Gutachter] Prof. Dr. Ahmadian, Reza [Gutachter]
Stichwörter:	Rho-GTPasen, GEF, GAP, ZellbiologieRho-GTPases, GEF, GAP, CellBiology
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibung:	Die GTPasen der Rho-Familie übernehmen als molekulare Schalter eine zentrale Rolle in der intrazellulären Signaltransduktion. Sie haben Einfluss auf die Organisation des Aktinzytoskeletts, die Regulation von Zellwachstum und Differenzierung und die Genexpression. Die Regulation der Aktivität der Rho-Proteine erfolgt durch GEFs, GAPs und GDIs, und die Signale aktivierter Rho-Proteine werden durch spezifische Effektoren weitergeleitet. Aber auch untereinander unterliegen die Rho-Proteine einer strengen Hierarchie. So wird beispielsweise durch Rac-Aktivierung Rho inaktiviert. Im Rahmen dieser Arbeit sollte die Regulation der Rho-GTPasen mit zellbiologischen Methoden näher charakterisiert werden. Der Schwerpunkt lag dabei auf der Klärung des Mechanismus der Rac-induzierten Rho-Inaktivierung. Nach erfolgreicher Etablierung der erforderlichen zellbiologischen Methoden, vor allem des GTPase Pulldown-Assays, konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass p190RhoGAP als ein zentrales Bindeglied des Rac-vermittelten Signalweges für die Inaktivierung von Rho verantwortlich ist. Die Regulation von p190RhoGAP und die darauf folgende Rho-Inaktivierung erfolgt schrittweise über Src-Kinase-abhängige Tyrosin-Phosphorylierung (Aktivierung) und über die Interaktion mit den SH2-Domänen von p120RasGAP (Rekrutierung zur Membran). Die Rac-induzierte Rho-Inaktivierung konnte durch den Eingriff in die p190RhoGAP-Regulation an drei Punkten erfolgreich unterbunden werden: 1. Inhibition der p190-Phosphorylierung durch den spezifischen Src-Kinase-Inhibitor PP1; 2. Dephosphorylierung von p190RhoGAP durch die Phosphatase LMW-PTP; 3. Inhibition der p190RhoGAP-p120RasGAP-Komplexbildung durch die Überexpression der N-terminalen SH2-Domäne von p120RasGAP. Zudem scheint die N-terminale GTPasen (S36N) die Inaktivierung von Rho über den Tiam1/ Rac-Signalweg inhibiert. Die Inaktivierung von Rho wird lediglich von Rac1, nicht aber von Rac2 und Rac3 vermittelt. Hierbei scheint der Rac1-/Pak-Signalweg ein wesentlicher Bestandteil zur Rac-induzierten Rho-Inaktivierung zu sein, der möglicherweise die Aktivierung von Src-Kinase herbeiführt. Mittels konfokaler Lasermikroskopie nach transienter Transfektion konnte gezeigt werden, dass die Rac-Isoformen sich in ihren morphologischen Effekten auf NIH3T3-Fibroblasten deutlich unterscheiden. Im Gegensatz zu konstitutiv aktivem Rac1 und Rac3 induziert konstitutiv aktives Rac2 nicht die für Rac typische Ausbildung von Lamellipodien, die mit dem Aktin-Zytoskelett kolokalisiert sind, was mit den bereits beschriebenen Funktionen der Rac-Isoformen in Zellen korreliert ist. Der Rac-GEF Tiam1 aktiviert Rac1 und Rac2, nicht aber Rac3, was damit zu erklären ist, dass Rac3 bereits ohne zusätzliche Aktivierung durch einen GEF in hohem Maß in der aktiven, GTP-gebundenen Form vorliegt. Rac1b, das im Gegensatz zu den anderen Rac-Isoformen eine Insertion von 19 Aminosäuren aufweist, und zuerst in Tumorgewebe gefunden wurde, ist im GTPase Pulldown-Assay im Gegensatz zu Rac1 unabhängig von den Serumbedingungen konstitutiv aktiv. Diese Beobachtung wird durch die Untersuchung der Morphol Von den getesteten RhoGEFs ist lediglich p115RhoGEF in der Lage die Rho-Isoformen RhoA, RhoB und RhoC gleichermaßen stark zu aktivieren. PDZ-RhoGEF hat eine schwächere GEF-Funktion auf RhoC als auf RhoA und RhoB, wohingegen für p190RhoGEF im Pulldown-Assay-System keine GEF-Aktivität auf eine der Rho-Isoformen nachgewiesen werden konnte. Der Unterschied zwischen p115RhoGEF und PDZ-RhoGEF ist wahrscheinlich auf unterschiedliche Lokalisation an der Plasmamembran zurückzuführen, während im Fall von p190RhoGEF ve! rmutlich Bindungspartner zur Inaktivierung der autoinhibitorischen Domäne fehlten. Immunpräzipitationen zur Bindung von Smad4 an Rac3 bestätigen die vorher im Hefe-2-Hybrid-System gefundene Interaktion beider Partner. Morphologische Studien mit konfokaler Lasermikroskopie zeigen, dass die Rekrutierung von Smad4 zur Plasmamembran abhängig von der Aktivierung von Rac3 ist. Es ist also denkbar, dass Rac3 die subzelluläre Lokalisation von Smad4 reguliert. Es sind jedoch weitere Experimente nötig um die Rolle der Rac3-Smad-Interaktion besser zu verstehen.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie
Dokument erstellt am:	14.05.2003
Dateien geändert am:	12.02.2007
Promotionsantrag am:	14.05.2003
Datum der Promotion:	14.05.2003