Dokument: Charakterisierung einer unbekannten
Redoxgruppe sowie der Konformation der NADH:Ubichinon Oxidoreduktase
(Komplex I) aus Escherichia coli

Titel:	Charakterisierung einer unbekannten Redoxgruppe sowie der Konformation der NADH:Ubichinon Oxidoreduktase (Komplex I) aus Escherichia coli
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=2232
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20020508-000232-2
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Hesterberg, Micaela [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 4,97 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 09.02.2007 / geändert 09.02.2007
Beitragende:	Prof. Dr. Weiss, Hanns [Gutachter] Prof. Dr. Friedrich, Thorsten [Gutachter]
Stichwörter:	Escherichia coli, Komplex I, Elektronenmikroskopie, AnalytischeUltrazentrifugation, UV/Vis Spektroskopie
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 540 Chemie
Beschreibung:	Die NADH:Ubichinon Oxidoreduktase (Komplex I) koppelt die Elektronenübertragung von NADH auf Ubichinon mit der Translokation von Protonen über die Membran. Der genaue Elektronenweg und die Kopplung zwischen Elektronen- und Protonentransport sind nur wenig verstanden. Der Komplex I aus dem Bakterium Escherichia coli besteht aus 13 Untereinheiten, NuoA bis N, und hat eine molekulare Masse von 535 kDa. Als Redoxgruppen wurden in dem isolierten Komplex I bislang ein Flavinmononukleotid (FMN) und 9 Eisen-Schwefel (FeS) Zentren nachgewiesen. Elektronenmikroskopische Aufnahmen mit einer Auflösung von etwa 35 Å zeigen eine L-förmige Über-Alles-Struktur des Enzyms mit einem peripheren Arm, der in das Cytosol ragt, und einem Membranarm, der in der Lipiddoppelschicht angeordnet ist. Der Winkel zwischen den beiden Armen ist variabel. Alle bisher bekannten Redoxgruppen sind im peripheren Arm des Komplexes lokalisiert. Darüberhinaus gibt es spektroskopische Hinweise aus unserem Institut auf eine weitere Redoxgruppe im Enzym, die aufgrund ihrer unbekannten chemischen Struktur als Gruppe X bezeichnet wird. Die Aufklärung der Struktur des Komplex I ist ein Forschungsschwerpunkt in unserem Institut. In dieser Arbeit wurde die Struktur des Komplex I durch Elektronenmikroskopie an mit Goldthioglukose kontrastierten Einzelpartikeln bei einer Auflösung von 17 Å erhalten. Es zeigte sich, daß Komplex I neben der bekannten L-förmigen Struktur noch eine weitere stabile Konformation besitzt, in der die beiden Arme parallel zueinander angeordnet sind. Die Konformation wurde als Hufeisen-Struktur bezeichnet. Beide Konformationen wurden durch Fällung des Komplexes mit Polyethylenglykol und durch analytische Ultrazentrifugation voneinander unterschieden. Der Wechsel zwischen den Konformationen wird durch die Ionenstärke des Puffers induziert und ist vollständig reversibel. Bei niedriger Ionenstärke herrscht die Hufeisen-Struktur vor. In detergenzhaltiger Lösung ist nur der Komplex in der Hufeisen- Struktur enzymatisch aktiv. Durch Zugabe von Salz wird die NADH:Ubichinon Reduktaseaktivität vollständig blockiert. Es wird diskutiert, daß die Hufeisen-Struktur die native Konformation des Komplexes darstellt. Um beide Arme der Hufeisen-Struktur dem peripheren und dem Membranarm zuzuordnen, wurde in dieser Arbeit Komplex I durch Inkubation bei pH 9,0 in das NADH Dehydrogenase Fragment und das Chinon Reduktase Fragment gespalten. Das NADH Dehydrogenase Fragment besteht aus den Untereinheiten NuoE, F und G und enthält das FMN und 6 FeS Zentren. Das Chinon Reduktase Fragment besteht aus den Untereinheiten NuoA bis D und NuoH bis N und enthält 3 FeS Zentren. Während das NADH Dehydrogenase Fragment zu klein für elektronenmikroskopische Untersuchungen ist, wurden anhand der Struktur des Chinon Reduktase Fragmentes bei 19 Å Auflösung der periphere Arm und der Membranarm der Hufeisen-Struktur des Komplex I identifiziert. Das Chinon Reduktase Fragment enthält die FeS Zentren N2, N6a und N6b und einen weiteren Chromophor, der UV/Vis spektroskopisch nachgewiesen wurde. Das Differenzspektrum dieses Chromophors ist dem der Gruppe X im Gesamtkomplex sehr ähnlich, mit breiten negativen Gipfeln um 325 und 420 nm. Durch Dialyse wurden die FeS Zentren fast vollständig aus dem Chinon Reduktase Fragment entfernt. Das Differenzspektrum des dialysierten Fragmentes zeigt ebenfalls das Spektrum der Gruppe X. Die Form des Spektrums änderte sich nach Zugabe des Detergenz SDS nicht, obwohl die Intensität der Absorptionen geringer wurde. Dies deutet auf eine kovalente Verknüpfung der Gruppe X mit dem Protein hin. Durch eine elektrochemisch induzierte Redoxtitration wurde ein Mittenpotential der Gruppe X von -100±30 mV bei pH 6,5 abgeschätzt und der Gruppe X eine Zwei-Elektronenübertragungsreaktion zugeordnet. Eine pH-Abhängigkeit des Mittenpotentials konnte nicht gezeigt werden, da die Gruppe X bei Wechsel des pH-Wertes von 9,0 auf 6,5 anscheinend eine chemische Reaktion eingeht.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Chemie
Dokument erstellt am:	08.05.2002
Dateien geändert am:	12.02.2007
Promotionsantrag am:	08.05.2002
Datum der Promotion:	08.05.2002