Dokument: Die Benzaldehydlyase aus Pseudomonas fluoreszens. Biochemische Charakterisierung und die Untersuchung von Struktur-Funktionsbeziehungen.

Titel:	Die Benzaldehydlyase aus Pseudomonas fluoreszens. Biochemische Charakterisierung und die Untersuchung von Struktur-Funktionsbeziehungen.
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=2229
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20021023-000229-7
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Janzen, Elena [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 2,98 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 09.02.2007 / geändert 09.02.2007
Beitragende:	Prof. Dr. Kula, Maria-Regina [Gutachter] PD Dr. Pohl, Martina [Gutachter] Prof. Dr. Weiss, Hanns [Gutachter]
Stichwörter:	Thyamindiphosphat, Klonierung, rekombinante Expression,Biotransformation, Acyloinkondensation, Hydroxyketone,Benzoin, Racematspaltung, gezielte Mutagenesethiamine diphosphate, clonierung, recombinante expression,biotransformation, acyloin condensation, hydroxy ketone, benzoin,racemic resolution, site-directed mutagenesis
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Das Thiamindiphosphat (ThDP)- und Mg2+ abhängige Enzym Benzaldehydlyse aus Pseudomonas fluoreszens war rekombinant exprimiert und hinsichtlich seiner proteinchemischen Eigenschaften und der katalytischen Aktivitäten charakterisiert. Von besonderem Interesse war die Untersuchung der Ligasereaktion der BAL, die zu chiralen 2-Hydroxyketonen führt, die wertvolle Bausteine in der Synthese von Naturstoffen und Pharmaka sind. Um den Zugang zu dem rekombinanten Protein zu erleichtern war die Benzaldehydlyse als Hexahistidinfusionsprotein kloniert. Nach Optimierung der Expression der recBAL(His)6 in E. coli wurde das Enzym aus dem Stamm SG13009 mittels IMAC an der Ni-NTA Agarose in einem Schritt bis zu Homogenität aufgereinigt. BAL katalysiert die Spaltung der Acyloinbindung der 2-Hydroxyketone unter Bildung von 2 Aldehydmolekülen. Das Enzym weist eine absolute Enantioselektivität und eine ausgeprägte Substratspezifität für die aromatische 2-Hydroxyketone auf. Dabei wurde eine 14 fach höhere Affinität der BAL für (R)-Benzoin im Vergleich zu der Affinität für (R)-Hydroxypropiophenon ((R)-HPP) nachgewiesen. Die spezifische Aktivität der BAL im Bezug auf (R)-Benzoin war 20 fach höher als die spezifische Aktivität im Bezug auf (R)-HPP. Es wurde gezeigt, dass BAL auch die C-C-Verknüpfung im sinne einer Acyloinkondensation katalysiert. Die spezifische Ligaseaktivität der BAL ausgehend von Benzaldehyd liegt 4,5 mal höher als die spezifische Lyaseaktivität hinsichtlich Benzoins. Damit könnte die Bildung der 2-Hydroxyketonen die natürliche Reaktion der BAL darstellen. BAL zeigte die Ligaseaktivität unter Bildung von (R)-2-Hydroxyketonen mit hohen ee-Werten (>98%) sowohl ausgehend von Aldehyden wie auch ausgehend von racemischen 2-Hydroxyketonen (in Zusammenarbeit mit IBT 2, Forschungszentrum Jülich). Durch die Racematspaltung konnten dabei auch die (S)-2-Hydroxyketone erhalten werden, wie z.B. das (S)-Benzoin, das bisher nicht durch enzymatische Katalyse zugänglich war. BAL akzeptiert ein breites Substratspektrum der aromatischen Donorsubstraten mit verschiedenen Substituenten. Als die Akzeptoren wurden von der BAL sowohl die aromatischen als auch die aliphatischen Aldehydede angenommen. BAL weist auch sehr niedrige Decarboxylaseaktivität ausgehend von Benzoylformiat auf, die auf ihre Verwandtschaft zu der a-Ketosäuredecarboxylasen hinweist. BAL zeigte eine hohe Stabilität in einem breiten pH- und Temperaturbereich neben einer starken Abhängigkeit der Stabilität von der Konzentrtionen der Cofaktoren. Es wurde außer dem der Einfluss der organischen Lösungsmitteln auf die Ligase- und Lyaseaktivität, wie auch auf die Enzymstabilität untersucht. Eine effektive Benzoinsynthese wurde in der Pufferlösung mit 20% DMSO gewährleistet, in der fast vollständige Umsetzung des Benzaldehyds zu Benzoin gelang. Anhand des Sequenzvergleichs der Proteinsequenzen der BAL und der verwandten ThDP-abhängigen Benzoylfornmiatdecarboxylyse (BFD), deren 3D-Struktur bekannt ist, konnten die für die katalytische Aktivität vermutlich relevanten Aminosäuren identifiziert und durch die gezielte Mutagenese verifiziert werden. Die meisten eingeführten Mutationen führten zu einer deutlich niedrigeren Lyaseaktivität bezüglich Benzoins. Außerdem wurde der Einfluss der bestimmten Mutationen auf die Bindungsstabilität der Cofaktoren gezeigt. Durch die Einführung der BFD-spezifischen Serin-Seitenkette anstelle des Alanins 28 der BAL wurde eine Enzymvariante mit einer deutlich höheren Decarboxylaseaktivität gewonnen, was auf die besondere Rolle des Serins in der gennaten Position hinweist und die Verwandtschaftsverhältnisse der beiden Enzyme bestätigt. The thiamin diphosphate and Mg2+ - dependent benzaldehyde lyase (BAL) from Pseudomonas fluoreszens was characterised concerning its enzymatic activities and biochemical features. Its suitability to catalyse the formation of 2 hydroxy ketones, which are versatile building blocks for organic and pharmaceutical chemistry was investigated. To facilitate the access to pure BAL for kinetical studies, stability investigations and synthetical applications, the coding gene was cloned into a vector allowing the expression of a hexahistidine fusion protein in E.coli. The E.coli strain SG13009 was found to be the most suitable as host for the production of the recombinant enzyme. Subsequent the recBAL(His)6 was isolated to homogeneity from the recombinant strain applying one chromatographical purification step on the Ni-NTA-Agarose. BAL catalyses the cleavage of the acyloin linkage of hydroxy ketones. The enzyme exhibits the absolute stereo selectivity beside the distinct substrate specificity for the aromatic compounds, whereas 14-fold higher affinity and 20-fold higher specific activity was found with regard to (R)-Benzoin when compared to (R)-Hydroxypropiophenone ((R)-HPP). It was demonstrated, that the BAL also catalyses the C-C-bond-formation in a benzoin-condensation reaction. The BAL showed the considerable higher specific activity for the carboligation as for the carbolyasereaktion, therefore the carboligation constitutes apparently the predominant physiological task of the enzyme. The enzyme accepts a wide range of donor substrates both aromatic 2- hydroxy ketones and aldehydes, which are ligated to aliphatic as well as to aromatic aldehydes as an acceptor yielding (R)-2-hydroxy ketones in very high optical purities with high chemical yields (cooperation with the Institute for biotechnology, Julich). Using enzymatic kinetic resolution of the racemates it was possible to produce the enantiopure (S)-hydroxyketones, for example (S)-Benzoin, that was previously not available by means of the enzymatic catalysis. Additionally the BAL was found to possess a low decarboxylase activity so the enzyme is possibly related to the a-decarboxylases. The high stability of BAL was showed in the broad pH and temperature range and was found to be most significantly a function of the cofactor concentrations. Besides the effects of the organic solvents on stability and specific activities for the C-C-bond cleavage and C-C-bond formation were investigated. The addition of 20% DMSO as cosolvent was especially useful for the enzymatic synthesis and resulted in the almost quantitative conversion of benzaldehyde to an enantiomeric pure (R)-Benzoin. Based on the allignment of amino acid sequences of BAL and related ThDP-dependent benzoylformate decarboxylase (BFD) from the Pseudomonas putida, which X-ray crystallographic data were known, the probable catalytic relevant residues of BAL were identified and verified applying the site directed mutagenesis. The most of the mutants showed the distinct lower specific activities towards benzoin. Additionally the effect of several mutations on the binding of cofactors was demonstrated. Alteration of A28 of BAL to BFD-specific serin has led to enzyme variant with considerable improved decarboxylase activity. This result points out the functional importance of above mentioned residue for the decarboxylase activity and confirms the relationship of both enzymes.
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Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie
Dokument erstellt am:	23.10.2002
Dateien geändert am:	12.02.2007
Promotionsantrag am:	23.10.2002
Datum der Promotion:	23.10.2002