Dokument:
Neue
Aminosäureoxidasen aus Rhodococcus opacus und Arthrobacter
protophormiae: Untersuchungen zur biochemischen Charakterisierung,
Klonierung und Expression
| Titel: | Neue Aminosäureoxidasen aus Rhodococcus opacus und Arthrobacter protophormiae: Untersuchungen zur biochemischen Charakterisierung, Klonierung und Expression | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=2225 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20020620-000225-0 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Deutsch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Geueke, Birgit [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Prof. Dr. Hummel, Werner [Gutachter] Prof. Dr. Freudl, R. [Gutachter] Prof. Dr. Weiss, Hanns [Gutachter] | |||||||
| Stichwörter: | Screening, L-Aminosäureoxidase,D-Aminosäureoxidase, Klonierung, Expression, Kristallisation,Präparative Anwendung, RacematspaltungScreening, L-amino acid oxidase, D-amino acid oxidase, Cloning,Expression, Crystallization, Preparative Application, Kinetic Resolution | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie | |||||||
| Beschreibungen: | In einem Screening von Bodenisolaten und Sammlungsstämmen wurde nach
neuen mikrobiellen L-Aminosäureoxidasen (L-AAOs) gesucht, um
über diese Enzyme alternative Wege zur Produktion von
D-Aminosäuren und Ketosäuren zu eröffnen. Der beste
untersuchte L-AAO-Bildner war Rhodococcus opacus DSM 43250, auch ein
D-Aminosäureoxidase (D-AAO)-Produzent wurde aus Bodenproben isoliert
und später als Arthrobacter protophormiae identifiziert.
Die L-AAO aus R. opacus wurde in zwei Chromatographieschritten mit guten
Ausbeuten bis zur Homogenität aufgereinigt und bio- und
proteinchemisch charakterisiert. Das Enzym weist ein sehr breites
Substratspektrum, niedrige KM-Werte für viele L-Aminosäuren und
eine absolute Stereoselektivität auf. Das laao Gen wurde durch
Southern Hybridisierung isoliert, anschließend sequenziert und die
Primärstruktur der L-AAO wurde aus der Gensequenz abgeleitet. Die
heterologe Expression dieses Enzyms in E. coli lieferte nur
unlösliches Protein, aber in Streptomyces lividans als alternativem
Wirtssystem wurde die L-AAO löslich exprimiert. Dabei lagen die
spezifischen Aktivitäten im Rohextrakt von S. lividans um den Faktor
3 höher als im Wildtyp. Die L-AAO bildete orthorhombische
Einkristalle, von denen bei Diffraktionsmessungen ein
Röntgenbeugungssatz bis zu einer Auflösung von 1,4 Å
aufgenommen wurde (in Zusammenarbeit mit dem Institut für Biochemie,
Universität Köln). Verschiedene Enzympräparationen der
L-AAO wurden hinsichtlich ihrer Fähigkeit zur Racemattrennung von
Aminosäuren untersucht. Mit sämtlichen L-AAO-Präparationen
wurden Enantiomerenüberschüsse von > 99% beobachtet.
Besonders geeignet bezüglich der Stabilität und
Wiederverwertbarkeit war auf Eupergit immobilisiertes Enzym. Die D-AAO
aus A. protophormiae wurde gereinigt und partiell charakterisiert. Die
N-terminale Sequenz dieses Enzyms weist hohe Homologien zu den bisher
bekannten eukaryotischen D-AAOs auf, die Substratspektren unterscheiden
sich jedoch deutlich. New amino acid oxidases from Rhodococcus opacus and Arthrobacter protophormiae: Biochemical characterization, cloning and expression A screening was performed to search for new bacterial L-amino acid oxidases (L-AAOs), which should be used to establish alternative enzymatic routes for the production of D-amino acids and keto acids. Rhodococcus opacus DSM 43250 was the most suitable L-amino acid oxidase producer found during this screening. Additionally, a bacterial D-amino acid oxidase (D-AAO) producing bacterium was isolated from a soil sample and identified as Arthrobacter protophormiae. The L-AAO from R. opacus was isolated to homogeneity with high yields applying two chromatographical purification steps. The enzyme exhibits a very broad substrate specificity, high affinity for many of these L-amino acids and absolute stereoselectivity. The complete laao gene was isolated by Southern Hybridization, sequenced and the primary structure of the L-AAO was deduced. Using E. coli as expression system for the L-AAO resulted in accumulation of completely insoluble enzyme, but it was possible to produce soluble L-AAO in Streptomyces lividans as host. A threefold higher specific activity in the crude extract was reached for the recombinant strain when compared to the wild type. The L-AAO was crystallized and X-Ray analysis showed that the obtained crystals diffract to a resolution of 1.4 Å (Cooperation with the Institute for Biochemistry, Cologne). The L-AAO was used for racemic resolution of DL amino acids. It was possible to reach ee-values of >99% with all tested enzyme preparations. L-AAO, which was immobilized on Eupergit, was especially useful concerning stability and reusability. The D-AAO from A. protophormiae was purified to homogeneity and partially purified. The N-terminal sequence shows high homologies to known eucaryotic D-AAOs, but the substrate specificity varies considerably. | |||||||
| Lizenz: |  Urheberrechtsschutz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie | |||||||
| Dokument erstellt am: | 20.06.2002 | |||||||
| Dateien geändert am: | 12.02.2007 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 20.06.2002 | |||||||
| Datum der Promotion: | 20.06.2002 |
