Dokument: Autodisplay of functional P450 enzymes in Escherichia coli

Titel:	Autodisplay of functional P450 enzymes in Escherichia coli
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=21921
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20120723-110558-3
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Schumacher, Stephanie Dorothee [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 34,35 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 19.07.2012 / geändert 19.07.2012
Beitragende:	Prof. Dr. Jose, Joachim [Gutachter] Prof. Dr. Gohlke, Holger [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 540 Chemie
Beschreibungen:	Cytochrom P450 Enzyme spielen aufgrund ihres großen Substratspektrums und ihrer Fähigkeit Sauerstoffatome regio- und stereoselektiv in nicht aktivierte C-H-Bindungen einzufügen sowohl in der chemischen, als auch in der pharmazeutischen Industrie eine große Rolle. In der vorliegenden Arbeit wurden das aus Bacillus megaterium stammende, lösliche CYP106A2 und das humane, membranständige CYP3A4 mittels Autodisplay auf die Oberfläche von Escherichia coli gebracht. Nach der Überprüfung der Oberflächenständigkeit beider P450 Enzyme wurden Aktivitätsmessungen durchgeführt. Hierfür wurde ein rekonstituierendes System, bestehend aus NADPH, AdR und Adx zu den CYP106A2 präsentierenden Zellen hinzugefügt, um einen erfolgreichen Elektronentransport zu dem P450 Enzym zu gewährleisten. Im Falle von CYP3A4 wurde statt der Cofaktoren AdR und Adx NADPH-P450-Reduktase eingesetzt. Die Produkte der enzymatischen Reaktionen wurden mittels HPLC-Analyse überprüft. Der CYP106A2 Ganzzellbiokatalysator (OD578=6) hydroxylierte das Substrat Deoxycorticosteron in 15β-Position und zeigte eine Aktivität von 0,3 μU/ml. Das oberflächenexprimierte CYP3A4 zeigte eine Hydroxylierung des Substrates Testosteron zu 6β-OH-Testosteron mit einer Wechselzahl von 5 Molekülen pro Zelle pro Minute. Durch die Etablierung eines photometrischen NADPH Assays konnte sowohl der Umsatz des Substrates Imipramin in das Produkt Desipramin, als auch die Hydroxylierung des Substrates Abietinsäure in das Produkt 12-OH-Abietinsäure durch CYP106A2 nachgewiesen werden. Beide P450 Enzyme waren aktiv, ohne dass eine externe Zugabe der prosthetischen Gruppe, des Häms, nötig war. Ein Kanal in der äußeren Membran, genannt TolC Kanal, ist für den Export von Häm in E. coli verantwortlich. Die Expression von CYP106A2 in einer TolC negativen E. coli Mutante führte zu einer deutlich verminderten Aktivität des Enzyms, welche durch die externe Zugabe von Häm wieder hergestellt werden konnte. Dies deutet darauf hin, dass die prosthetische Gruppe der P450 Enzyme durch die E. coli Zellen selbst ausgeschleust und dann von außen in das sich auf der Oberfläche befindliche Enzym inkorporiert wird. Due to their large variety of substrates and their capability to insert a molecular oxygen regio- and stereoselectively into non-activated C-H-bonds, cytochrome P450 enzymes play an important role in the pharmaceutical and chemical industry. In this study the soluble, bacterial CYP106A2 from Bacillus megaterium and the human, membrane bound CYP3A4 were expressed on the cell surface of Eschericha coli by the aid of the Autodisplay system. After successful surface display was confirmed activity measurements were perfomed. A reconstituted system containing NADPH, AdR and Adx was externally added to the whole cell CYP106A2 biocatalyst supplying the enzymes on the surface of E. coli with the necessary reducing equivalents for the reaction. In the case of CYP3A4 the cofactors AdR and Adx were replaced by NADPH-P450-Reductase. The obtained reaction products were analyzed by HPLC measurements. The CYP106A2 whole cell biocatalyst (OD578=6) converted the substrate deoxycorticosterone into the product 15β-OH-deoxycorticosterone and showed an activity of 0.3 μU/ml. The surface displayed CYP3A4 converted 5 molecules per cell per minute of the substrate testosterone into the product 6β-OH-testosterone. A newly established NADPH turnover assay revealed the conversion of the substrate imipramine into the product desipramine as well as the conversion of the substrate abietic acid into the product 12-OH-abietic acid by the displayed CYP106A2. Both P450 enzymes were active without the external addition of the heme prosthetic group. An outer membrane channel called TolC is involved in the export of the heme group. The expression of CYP106A2 in a TolC negative E. coli strain lead to a reduced activity, which could be recovered by the external addition of the heme group. This indicates that the prosthetic groups are exported by the E. coli cells into the growth medium, where they can be incorporated into P450 enzymes folding at the surface.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Pharmazie » Pharmazeutische und Medizinische Chemie
Dokument erstellt am:	23.07.2012
Dateien geändert am:	23.07.2012
Promotionsantrag am:	02.05.2012
Datum der Promotion:	05.07.2012