Dokument: Screening, biochemische Charakterisierung und Strukturaufklärung mikrobieller Threonin-Aldolasen

Titel:	Screening, biochemische Charakterisierung und Strukturaufklärung mikrobieller Threonin-Aldolasen
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=21805
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20120709-100706-0
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Dückers, Nina [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 3,67 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 05.07.2012 / geändert 05.07.2012
Beitragende:	Prof. Dr. Hummel, Werner [Gutachter] Prof. Dr. Manfred Braun [Gutachter]
Stichwörter:	Biokatalyse, Threonin-Aldolasen, β-Hydroxy-α-aminosäuren, Aldolreaktion
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Aldolasen, die die C-C-Verknüpfung von Benzaldehyd und Glycin unter Bildung von Phenylserin katalysieren, sind im Prinzip literaturbekannt, natürlicherweise handelt es sich dabei um Threonin-Aldolasen. Da bei dieser Synthese zwei neue Asymmetriezentren (in α- und ß-Position) gebildet werden, werden allerdings hohe Anforderungen an die Enantio- und Diastereoselektivität dieser Enzyme gestellt. Bei Auswertung der Literaturdaten zeigt sich, dass die bislang beschriebenen Enzyme Produkte bilden, die durchweg in α-Position eine hohe Enantioselektivität (> 99% ee) zeigen, während alle bislang bekannten Enzyme nur eine niedrige Diastereoselektivität in β-Position aufweisen. Threonin-Aldolasen und verwandte Enzyme mit Threonin-Aldolase-Aktivität (z.B. die Serinhydroxymethyltransferasen SHMTs) können für die Synthese von multifunktionellen β-Hydroxy-α-aminosäuren genutzt werden, da sie in der Lage sind, die stereoselektive C-C Knüpfung unter Entstehung zweier neuer Chiralitätszentren in einem einzelnen Schritt zu katalysieren. Diese β-Hydroxy-α-aminosäuren sind bedeutende chirale Bausteine für die Synthese biologisch aktiver Moleküle, die in den letzten Jahren für chemisch industrielle Prozesse, insbesondere für die Pharma-Industrie, an steigendem Interesse gewonnen haben. Jedoch gibt es einige Limitierungen der Threonin-Aldolase-Reaktion, wie die meist unzureichenden Umsätze und Ausbeuten und die geringen Diastereoselektivitäten im Vergleich zu exzellenten Enantioselektivitäten (bis zu 99% ee). Ziel dieser Arbeit war es, verbesserte Enzyme mit optimierter Diastereoselektivität für die Synthese der chiralen β-Hydroxy-α-aminosäuren zu identifizieren und zu isolieren und somit den Limitierungen der konventionellen chemischen Synthese-Prozesse nachzukommen. Zwei literaturbekannte Enzyme (aus E. coli und Saccharomyces cerevisiae) sind für dieses Projekt rekombinant verfügbar gemacht worden, da sie als Referenzenzyme für methodische Ausarbeitungen gut einsetzbar sind, beispielsweise für die Entwicklung einer Immobilisierungsmethode, für die Etablierung einer Enantio- und Distereomeren-Analytik oder die Ausarbeitung einer Hochzelldichte-Fermentation zur Gewinnung größerer Zellmassen. Ausgehend von der Threonin-Aldolase LTAE aus E. coli wurde eine gezielte Mutagenese durchgeführt, um optimierte Enzyme mit verbesserter Diastereoselektivität zu erhalten. Eine Mutante zeigte eine verbesserte Diastereoselektivität im Vergleich zum Wildtyp-Enzym und eine sehr hohe Aktivität für die Spaltung von Threonin in der Retro-Aldolreaktion. Außerdem wurde die LTAE im Rahmen dieser Arbeit kristallisiert und die Struktur des Enzyms (sowohl Apo-Enzym als auch Enzym mit Substrat Glycin) aufgeklärt. Mittels verschiedener Screeningansätze sollten im Rahmen dieser Arbeit neue Threonin-Aldolasen mit optimierter Diastereoselektivität für die Synthese eines relevanten Intermediates der Thiamphenicol-Synthese, einer ß-Hydroxy-α-aminosäure, zugänglich gemacht werden. Ziel war es hierbei, hoch threo-spezifische Enzyme zu identifizieren, da nur die threo-Verbindung als chirales Intermediat für Folgesynthesen von großer Bedeutung ist. Hierbei wurde zum einen definierte Stammsammlungen nach neuen, vielversprechenden Enzymen durchsucht, zum anderen wurden verschiedene Bodenproben mit der zu verwertenden Kohlenstoff-Quelle (Phenylserin, einer ß-Hydroxy-α-aminosäure) angereichert und auf Threonin-Aldolase-Aktivität getestet. Außerdem wurde ein „in Silico“-Screening auf Basis der beiden bekannten Threonin-Aldolase-Sequenzen (E. coli und S. cerevisiae TA) durchgeführt. Der Zugang zu den neuen Enzymen sollte durch eine selektionsbasiertes Screening mithilfe eines speziellen Selektions-Systems in Pseudomonas putida KT2440 gewährleistet werden. Dieser Stamm ist in der Lage auf Benzaldehyd, dem Spaltprodukt der Threonin-Aldolase-Reaktion ausgehend von Phenylserin als Substrat, zu wachsen, indem er dieses im Mandelat-Abbauweg verstoffwechselt. Jedoch verfügt der Stamm auch über eine eigene, aktive Threonin-Aldolase (PpTA), die ebenfalls näher untersucht wurde, und kann nur nach Deletion dieses Gens als Selektions-Stamm für die Identifizierung neuer Aldolase-Gene genutzt werden. Die Konstruktion dieser Deletionsmutante des Selektions-Stammes konnte jedoch im Rahmen dieser Arbeit nicht mehr erfolgen. Die verschiedenen Screening-Ansätze erwiesen sich als erfolgreich. Es konnten neue Enzyme mit deutlich verbesserten d.r.-Werten in der Aldolreaktion für die ß-Hydroxy-α-aminosäure Phenylserin gefunden werden. Enzyme mit sehr guten Diastereoselektivitäten für die threo-Verbindung als Produkt wurden in in Bodenproben-Stämmen, durch Anreicherung dieser Organismen mit Phenylserin, gefunden. Diese lieferten im Vergleich zu den bisher in der Literatur beschriebenen Enzymen signifikant verbesserte Resultate für die enzymatische Aldolreaktion. Das ”in Silico-Screening” lieferte 5 neue rekombinante Enzyme mit threo-Spezifität, wobei hier die Umsätze für die enzymatische Aldreaktion sehr hoch waren. Die Etablierung des Selektions-Systmes in P. putida durch Deletion des Stamm-eigenen TA-Gens würde einen Zugang zu diesen neuen Threonin-Aldolase-Genen liefern. Aldolases, that catalyze the carbon-carbon bond coupling of benzaldehyde and glycine under the formation of phenylserine, are in principle known from literature, naturally, they are threonine aldolases. As two new asymmetric centres (in α- and β-position) in this synthesis will be formed, heavy demands are made on the enantio- and diastereoselectivity of these enzymes. From literature data is known, that the previously described enzymes form products that consistently show a high enantioselectivities in α-position, while only poor diastereoselectivities in β-position are described. Threonine aldolases and related enzymes with threonine aldolase activity (for example the serinehydroxymethyltransferases SHMTs) can be used for the synthesis of multifunctional β-hydroxy-α-aminoacids, because of their ability to catalyze the stereospezific C-C bond coupling under formation of two new chiral centres in one single step. These β-hydroxy-α-aminoacids are important chiral building blocks for the synthesis of biologically active molecules, which have become an emerging tool for the industrial production of chemicals, in particular for fine chemicals and drug production. But there are still some limitations in the threonine aldolase reaction, like the poor conversions, yields and low diastereoselectivities in comparison to excellent enantioselectivities. The aim of this work was to identify and isolate enzymes, with optimized diastereoselectivity for the synthesis of chiral β-hydroxy-α-aminoacids and therefore to overcome the limitations of conventional chemical synthesis. Two of those enzymes (from E. coli and S. cerevisiae) were made recombinantly available for this project, because they are well used as reference enzymes for the methodological elaborations, such as the development of an immobilization method, for the establishment of enantio- and diastereomeric analytics or the development of a high-cell-density fermentation for production of larger cell masses. Based on the threonine aldolase from E. coli, LTAE, a targeted mutagenesis in position 87 of the enzyme was performed to obtain optimized enzymes with improved diastereoselectivity. One mutant (by exchange of aminoacid phenylalanine87 against tryptophan) shows an improved diastereoselectivity and a very high activity for the cleavage of threonine as substrate in the aldolreaction. In addition, the LTAE protein was analyzed by X-ray crystallization and the structure of the enzyme could be solved. By the use of various screening-approaches, new threonine aldolases with improved diastereoselectivity for the synthesis of a β-hydroxy-α-aminoacid , an intermediate in synthesis of the antiobiotic thiamphenicole, should be made available. The aim was to identify highly threo-specific enzymes, because only the threo-compound, as a chiral intermediate for subsequent synthesis, is of great importance. On the one hand defined strain collections were screened for new promising enzymes, on the other hand several soil smaples with their hugh diversitiy of microorganisms were enriched with the desired carbon source (phenylserin as β-hydroxy-α-aminoacid) and tested for threonine aldolase activity. In addition an in silico- screening based on the two known threonine aldolase sequences from E. coli and S. cerevisiae was performed. An access to the new aldolase-genes should be given by a selection based screening system using a special selection strain P. putida KT2440. This strain is able to grow on benzaldehyde, the cleavage product of the threonine aldolase reaction from phenylserin, by its metabolisation in the mandelic degradation pathway. However, this strain also has its own active threonine aldolase (PpTA), which has been analyzed in detail, and can only be used as selection strain for the identification of new aldolase-genes after deletion of that gene. So far the construction of this deletion mutant in P. putida KT2440 could not be established in this work. However, the different screening methods were succesful. New enzymes with significantly improved d.r.-values in the aldol reaction of β-hydroxy-α-aminoacid could be found. Enzymes with very good diastereoselectivities for the threo-compound as product were found in strains isolated from soil samples by the enrichment of these organisms with phenylserine as carbon source. In comparison to the previously in literature described enzymes they show significantly improved results for the enzymatic aldol reaction. The in silico-screening resulted in five new recombinant enzymes with low threo-preference, but excellent conversions up to 90%. These are very high values, since the poor conversions are often a limitation in the enzymatic aldolreaction. The establishment of the selection systeme in P. putida by deletion of the active aldolase of this strain, would provide an access to the new aldolase-genes.
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Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Chemie
Dokument erstellt am:	09.07.2012
Dateien geändert am:	09.07.2012
Promotionsantrag am:	15.08.2011
Datum der Promotion:	10.11.2011