Dokument: Die
Hydroxynitril-Lyasen aus Linum usitatissimun (Lein) und Sorghum
bicolor (Hirse) - Untersuchungen zur rekombinanten Expression und
phylogenetischen Verwandtschaft -

Titel:Die
Hydroxynitril-Lyasen aus Linum usitatissimun (Lein) und Sorghum
bicolor (Hirse) - Untersuchungen zur rekombinanten Expression und
phylogenetischen Verwandtschaft -
URL für Lesezeichen:https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=2180
URN (NBN):urn:nbn:de:hbz:061-20020513-000180-4
Kollektion:Dissertationen
Sprache:Deutsch
Dokumententyp:Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:Text
Autor: Heim, Petra [Autor]
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Dateien vom 09.02.2007 / geändert 09.02.2007
Beitragende:Prof. Dr. Kula, Maria-Regina [Gutachter]
Prof. Dr. Hummel, Werner [Gutachter]
PD Dr. Pohl, Martina [Gutachter]
Stichwörter:Hydroxynitril-Lyasen, Cyanogenese,Zn-abh. Alkohol-Dehydrogenasen, Carboxypeptidasen, Linum usitatissimum,Sorghum bicolor .
Dewey Dezimal-Klassifikation:500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibung:Die (R)-HNL aus Linum usitatissimum [LuHNL] und die (S)-HNL aus Sorghum bicolor [SbHNL] waren die rekombinant zu exprimierenden und hinsichtlich ihrer Verwandtschaftsverhältnisse zu charakterisierenden Enzyme der vorliegenden Arbeit. Nach Optimierung der Expression der recLuHNL(His)6 in E. coli wurde das Enzym aus dem Stamm AD494 mittels IMAC an Ni-NTA-Agarose in einem Schritt homogen aufgereinigt. Die Reinigung der recLuHNL ohne Hexahistidinrest im bereits existierenden Pichia-Expressionssystem GS115 wurde ebenfalls bis zur Homogentität nach SDS-PAGE erreicht. Die Prozedur konnte im Vergleich zur Isolierung der wtLuHNL um 2 Stufen verkürzt und in ihrem Reinigungserfolg verbessert werden. Der Versuch einer optimalen Aufreinigung der recLuHNL(His)6 aus dem ebenfalls bereits existierenden Pichia-System SMD1168 resultierte in der Identifizierung einer bislang unbekannten Alkoholdehydrogenase (ADH) aus P. pastoris. Die HNL aus Linum und die Klasse der zinkabhängigen ADHn besitzen zu 49% ähnliche Aminosäuren. Dazu gehören folgende charakteristische Merkmale der ADHn:
▪ADP-bindende Sequenzmotiv [bietet die Topologie zur NAD(P)-Bindung] ▪Liganden für strukturell und katalytische essentielle Zinkionen ▪Strukturell wichtige Glycine
Zur Aufklärung der Bedeutung dieser Reste für die Aktivität und Stabilität bzw. Konformation der LuHNL wurden Enzymtests mit den Cofaktoren NAD(P)H und Zn2+ bei einer Temperatur von 50°C durchgeführt. Zinkionen haben einen wesentlich deutlicheren Einfluss auf den Erhalt ihrer Stabilität bei erhöhten Temperaturen als die Dinukleotide. Weiterführende Untersuchungen zur NAD(P)H-Bindung mittels fluoreszenzspektroskopischer Methoden lassen eine effektive NAD(P)H-Fixierung nicht vermuten.Ein mittels SWISS-Modell und pdb- Viewer generiertes 3D-Modell, basierend auf der Homologie der LuHNL zu bereits in ihrer Kristallstruktur aufgeklärten ADHn, diente als ausgezeichnete Grundlage zur Identifizierung mechanistisch relevanter Aminosäuren. Ein Lyasezentrum bestehend aus einer katalytischen Triade D66-H85-T111 konnte nach Ansicht des Homologiemodells bestimmt und durch gerichtete Mutagenese verifiziert werden.
Die SbHNL besitzt eine markante Homologie von 57% identischen Aminosäuren zur Serin-Carboxypeptidase aus Weizen [CPII-W]. Dies spiegelt sich in einem ähnlichen Enzymaufbau, bestehend aus einer glykosylierten und über Disulfidbrücken verbundenen heterotetrameren Struktur und einem α/ß-Hydrolase Faltungsmuster mit katalytischer S216-D415-H472 Triade wieder. Große [33kDa] und kleine [23kDa] Untereinheit reifen aus einem Präprotein.Diese Übereinstimmungen waren ebenfalls Grundlage zur Generierung eines 3D-Modells der SbHNL. Eine schwache Carboxypeptidase- und Esterase-Nebenaktivität konnte der SbHNL nachgewiesen werden. Hauptziel der Arbeiten zur SbHNL war nach Klonierung dessen funktionelle rekombinante Expression. Trotz erfolgreicher Expression und Sekretion des recSbHNL- Präprotein ist dessen proteolytische Spaltung beeinträchtigt.
Die Untersuchungen der beiden Enzyme hinsichtlich ihrer phylogenetischen Verwandt-schaftsverhältnisse erweiterten die Hypothese ihrer Entwicklung aus Vorläuferproteinen ursprünglich unterschiedlicher Funktion. Die in dieser Arbeiten gewonnen Erkenntnisse zu LuHNL und SbHNL lassen zusammen mit dem aufgeklärten Katalysemechanismus der HbHNL die katalytische Triade als generalisiertes Motiv bei den Lyasen stark vermuten. .
Fachbereich / Einrichtung:Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie
Dokument erstellt am:13.05.2002
Dateien geändert am:12.02.2007
Promotionsantrag am:13.05.2002
Datum der Promotion:13.05.2002
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