Dokument: Die Rolle des CSB-Proteins bei der neuronalen Entwicklung und Hypoxie-induzierten Transkription

Titel:	Die Rolle des CSB-Proteins bei der neuronalen Entwicklung und Hypoxie-induzierten Transkription
Weiterer Titel:	The role of CSB protein in neuronal development and hypoxia-induced transcription
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=21694
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20120622-093931-9
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Schumacher, Christine [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 3,92 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 19.06.2012 / geändert 19.06.2012
Beitragende:	Prof. Dr. Krutmann, Jean [Gutachter] Prof. Dr. Willbold, Dieter [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Das Cockayne Syndrom (CS) ist eine autosomal rezessive Erkrankung, die von einer Vielzahl an klinischen Symptomen charakterisiert ist. Hierzu zählen Störungen der neuronalen Entwicklung, Wachstumsdefizite, eine erhöhte Photosensitivität und Anzeichen von frühzeitigem Altern. Während die fötale Entwicklung der Patienten normal abläuft, treten die meisten Symptome des klassischen Syndroms (CS Typ I) in den ersten beiden Lebensjahren auf. Die beiden Hauptmerkmale der neurologischen Defekte sind Demyelinisierung der weißen Substanz und neuronale Atrophie, die besonders stark im Kleinhirn vertreten ist und in Störungen der Motorkoordination resultiert. Etwa 80% aller CS-Erkrankungen sind auf Mutationen im CSB-Gen zurückzuführen. Von CSB ist bekannt, dass es eine wichtige Funktion bei der transkriptionsgekoppelten Reparatur (TCR), einer Unterform der Nukleotidexzisionsreparatur, hat. Diese ist essentiell für die Reparatur von bestimmten DNS-Schäden wie z.B. UV-induzierten Läsionen in der Haut. Man geht jedoch davon aus, dass CSB noch weitere Funktionen besitzt. Die Mehrheit der neurologischen Schäden bei CS-Patienten kann nämlich nicht durch einen ausschließlichen Defekt der TCR erklärt werden. Eine Funktion von CSB bei der neuronalen Entwicklung und Transkription wird daher stark vermutet. Aufbauend auf Befunden, in denen humane CSB-defiziente Fibroblasten nicht adäquat auf geringe Sauerstoffkonzentrationen reagierten und dabei Hypoxie-induzierte Signalwege nur unzureichend aktivieren konnten, wurde die Hypothese aufgestellt, dass dieser, für die Gehirnentwicklung essentielle Mechanismus, in CSB-defizienten Organismen gestört ist. In dieser Arbeit sollte die Auswirkung von hypoxischen Bedingungen auf die CSB-vermittelte Hirnentwicklung und Transkription im Mausmodell untersucht werden. Zuerst wurden CSB-defiziente Mäuse nach ihren äußeren CS-Symptomen charakterisiert. Die Tiere, die in früheren Studien bereits durch Koordinations- und Verhaltensstörungen auffielen, wiesen im Alter von acht Wochen eine signifikant reduzierte Körper- und Gehirnmasse auf. Da apoptotische Prozesse zu diesem Zeitpunkt ausgeschlossen werden konnten, wurde die neurale Entwicklung des Kleinhirns analysiert. Histologische Untersuchungen des Kleinhirns am postnatalen Tag 12 zeigten aber keine offensichtlichen Entwicklungsdefekte der Purkinje-, Bergmann Gliazellen und Körnerzellschicht. Die Myelinisierung der weißen Substanz war ebenfalls weitestgehend gleichmäßig ausgeprägt. Dies lässt auf eine milde Ausprägung des neurologischen CS-Phänotyps in den CSB-defizienten Mäusen schließen. Da bereits gezeigt wurde, dass humane CSB-defiziente Fibroblasten eine gestörte Hypoxie-Antwort aufweisen, wurde die Expression von Hypoxie-induzierten Genen im Kleinhirn analysiert. Dabei wurde beobachtet, dass der vaskuläre endotheliale Wachstumsfaktor VEGF im Kleinhirn CSB-defizienter Mäuse signifikant schwächer exprimiert war, was in einer signifikant reduzierten Anzahl und einer Rarefizierung von Blutgefäßen im Kleinhirn resultierte. Darüber hinaus wurde eine signifikant verminderte Expression der Histonacetyltransferase p300 auf mRNS- und Proteinlevel gefunden. P300 gilt als Cofaktor des Hypoxie-induzierbarer Faktors-1 (HIF-1) und ist für die Transaktivierung der HIF-1-abhängigen Genexpression essentiell. Ein reduzierter Level an p300 war besonders in den Purkinjezellen des Kleinhirns zu beobachten, welche extrem sensitiv für Sauerstoff-Konzentrationsänderungen sind. Um zu untersuchen, welche Auswirkungen geringe Sauerstoffkonzentrationen, wie sie auch physiologisch im Gehirn vorkommen, auf die Gehirnentwicklung bei CSB-Defizienz haben, wurden Neurosphären aus cerebellaren neuralen Vorläuferzellen generiert und bezüglich klassischer Entwicklungsparameter untersucht. Dabei waren keine Unterschiede in der Migration und Differenzierung der Vorläuferzellen in Neuronen und Oligodendrozyten unter 1% O2 zu beobachten. Allerdings bewirkten hypoxische Konditionen eine signifikante Reduktion der Neurosphären-Proliferation, was in den CSB-defizienten Zellen verstärkt war. Aus diesem Grund wurde in proliferierenden Kleinhirn-Neurosphären die Transkription der HIF-1-induzierten Gene VEGF, GLUT-1 und HMOX1 unter Hypoxie analysiert. Deren Induktion war speziell für die Gene VEGF und GLUT-1 in den CSB-defizienten Sphären signifikant reduziert. Die verminderte Expression der genannten Gene ließ sich durch Zugabe des HDAC-Inhibitors SAHA sowie des Sirtuin-Inhibitors Sirtinol an die normale Induktion in Wildtyp-Neurosphären angleichen. Diese Befunde deuten zum einen darauf hin, dass CSB eine Rolle bei der Aktivierung der Hypoxie-abhängigen Transkription spielt und zum anderen, dass dieser Mechanismus über die Modulation der Protein-Acetylierung gesteuert wird. Unter Verwendung von CSB-defizienten embryonalen Mausfibroblasten konnte darüber hinaus gezeigt werden, dass diese Zellen unter hypoxischen Bedingungen signifikant nicht in der Lage sind, die proteasomal regulierte HIF-1-Untereinheit HIF-1α adäquat zu stabilisieren. Eine Stabilisierung von HIF-1α ist essentiell für die transkriptionelle Antwort auf Hypoxie. Die Stabilisierung von HIF-1α in den CSB-defizienten Zellen konnte durch SAHA und den Proteasom-Inhibitor β-Lacton wiederhergestellt werden. Dies lässt vermuten, dass CSB auch eine Rolle bei der Regulation des Ubiquitin-vermittelten proteasomalen Abbaus von Proteinen spielt und dadurch Einfluss auf die Transkription nimmt. Zusammengefasst lassen die in dieser Arbeit gezeigten Ergebnisse darauf schließen, dass die neurologischen Defekte bei CS-Patienten im Zusammenhang mit einer unzureichenden transkriptionellen Antwort auf geringe Sauerstoffkonzentrationen im Gehirn stehen könnten. Cockayne Syndrome (CS) is an autosomal recessive disorder characterized by a variety of clinical symptoms including neurodevelopmental impairment, growth retardation, increased photosensitivity and signs of premature aging. While patients with the classical form (CS type I) display normal fetal development, symptoms arise in the first or second year of life. The predominant neurological defects are demyelination of the white matter and neuronal atrophy particularly within the cerebellum resulting in an impaired motor control. About 80% of all CS-cases are caused by mutations in the CSB gene. CSB plays an important role in transcription-coupled repair (TCR), a subpathway of nucleotide excision repair. TCR is essential for the repair of certain types of DNA damage including UV-induced lesions in the skin. However, as most neurological disorders of CS patients cannot simply be explained by a defect in TCR, CSB is considered to have additional functions. It is strongly assumed that CSB plays a role in neuronal development and transcription. Recently, it has been reported that human CSB-deficient fibroblasts are unable to cope with low oxygen concentrations and therefore cannot activate hypoxia-induced signaling. Based on these findings it has been hypothesized that the hypoxic response, which is essential for brain development, is dysregulated in CSB-deficient organisms. The aim of this work was to investigate the effect of hypoxic conditions on CSB-mediated brain development and transcription in a mouse model. Given that CSB-deficient mice showed dysregulated motor coordination in previous studies, the focus of the first investigations of this work was set on apparent CS-symptoms in the mice. It was found that at the age of eight weeks the CSB-deficient mice had significant lower body and brain weights compared to littermates. Because apoptotic processes could be excluded, the neural development of the cerebellum was analyzed. Histological examinations of the cerebellum at postnatal day 12 showed no obvious developmental defects of the Purkinje and Bergmann glia cells and the granule cell layer. The myelination status of the white matter was also comparable to wildtype animals. This suggests only a mild appearance of the neurological CS-phenotype in the CSB-deficient mice. As it has been shown that human CSB-deficient fibroblasts show a dysregulated hypoxic response, the expression of hypoxia-induced genes in the cerebellum was analyzed. It was observed that the expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) was significantly reduced in the cerebellum of CSB-deficient mice. This resulted in a significantly reduced number and rarefication of blood vessels in the cerebellum. Furthermore, a significantly decreased expression of the histone acetyltransferase p300 on mRNA and protein level was observed. P300 is a cofactor of the hypoxia-inducible factor-1 (HIF-1) and is essential for the transactivation of HIF-1-inducible gene expression. A reduced level of p300 was observed particularly within the Purkinje cells, which are extremely sensitive for changes in oxygen concentration. To investigate the effect of physiologically low oxygen concentrations on the brain development in CSB-deficient cells, neurospheres from cerebellar neural stem cells were generated and characterized by analyzing classical developmental parameters. No differences in migration or differentiation of the progenitor cells into neurons and oligodendrocytes could be observed under hypoxic conditions. However, hypoxic conditions resulted in a significant reduction of the neurosphere proliferation, an effect which was enhanced in CSB-deficient cells. Therefore the expression of HIF-1-inducible genes VEGF, GLUT-1 and HMOX was analyzed in proliferating cerebellar neurospheres. The reduced induction of those genes in the CSB-deficient cells was significant for VEGF and GLUT-1. However, reduced expression could be restored to levels observed in wildtype neurospheres by adding HDAC inhibitor SAHA or sirtuin inhibitor sirtinol. These results indicate that on the one hand CSB plays a role in activating hypoxia-induced transcription and on the other hand this mechanism is regulated by modulating protein acetylation. Using CSB-deficient embryonic mouse fibroblasts it could be shown that these cells are significantly unable to stabilize the proteasomal regulated HIF-1 subunit HIF-1α under hypoxic conditions. Stabilization of HIF-1α is essential for a proper transcriptional hypoxic response. It could be restored in the CSB-deficient cells by SAHA and the proteasome inhibitor β-Lacton. This leads to the assumption that CSB plays also a role in the regulation of the ubiquitin-mediated proteasomal degradation of proteins and therefore influences transcription. All together these results suggest a connection between the neuropathology of CS patients and an improper response to low oxygen concentrations in the brain.
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Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie
Dokument erstellt am:	22.06.2012
Dateien geändert am:	22.06.2012
Promotionsantrag am:	13.04.2012
Datum der Promotion:	15.06.2012