Dokument:
Kristallisation und
NMR-spektroskopische Untersuchungen an dem
Twisted Dwarf Protein aus Arabidopsis thaliana
| Titel: | Kristallisation und NMR-spektroskopische Untersuchungen an dem Twisted Dwarf Protein aus Arabidopsis thaliana | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=2165 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20021115-000165-7 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Deutsch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Eckhoff, Andreas [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Prof. Dr. Büldt, Georg [Gutachter] Prof. Dr. Willbold, Dieter [Gutachter] | |||||||
| Stichwörter: | Twisted Dwarf, TWD, FKBP, Immunophilin,Arabodpsis thaliana, Kristallisation, NMR | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie | |||||||
| Beschreibung: | Das Twisted-Dwarf (TWD) - Protein aus Arabidopsis thaliana gehört zu der Klasse der FK506 bindenden Proteine (FKBP). Proteine dieser Klasse werden häufig in Multiproteinkomplexen gefunden. TWD(-)-Pflanzen zeigen einen pleiotropen Phänotyp, der sowohl in starkem Maße die Morphologie als auch den Entwicklungszyklus der Pflanze betrifft. In dieser Arbeit wurden zunächst Protokolle zur heterologen Expression des TWD-Proteins in E.coli und zur Reinigung des rekombinanten Proteins entwickelt. Durch molekularbiologische Methoden wurde dem TWD C-terminal ein Affinitätstag angefügt. Die Reinigung erfolgte sequentiell über IMAC, Gelfiltrations- und Ionenaustauschchromatographie. Sowohl Reinheit als auch Menge an rekombinantem Protein reichten für eine eventuelle Kristallisation aus. Allerdings war es nicht möglich, das Protein auf mehr als 2 mg/ml zu konzentrieren. Aus diesem Grund wurde mit zwei verkürzten Konstrukten des TWD-Proteins, die von T.Kamphausen (Max-Planck-Forschungsstelle für Enzymologie der Proteinfaltung, Halle/Saale) zur Verfügung gestellt wurden, weitergearbeitet: TWD ohne Membrananker (TWD-MA) und der N-terminalen FKBP-Domäne (TWD12D). Unter Verwendung von Na-Formiat konnte TWD-MA und von Ammoniumsulfat und Ammoniumphosphat als Fällungsmittel konnte TWD12D kristallisiert werden. Zu bemerken ist die sehr lange Kristallisationszeit von bis zu einem Jahr. Im Fall des TWD-MA konnten Synchrotrondatensätze (ESRF-Grenoble, ID14-1) dreier nativer und dreier mit Schweratomen derivatisierter Kristalle aufgenommen werden. Mit diesen Datensätzen wird derzeit mit Hilfe des isomorphen Ersatzes die Molekülstruktur des TWD-MA bestimmt. Erste Röntgenbeugungsaufnahmen eines TWD12D Kristalles zeigen eine sehr gute Diffraktion, die bei Synchrotronstrahlung eine Auflösung von etwa 2 Å haben wird. Neben den röntgenkristallographischen Untersuchungen w! urden auch NMR- spektroskopische Experimente zur Bestimmung der dreidimensionalen Struktur durchgeführt. Zu diesem Zweck wurde das TWD12D mit Isotopen markiert. Alle notwendigen Experimente zur Resonanzzuordnung wurden durchgeführt und die Zuordnung begonnen. | |||||||
| Lizenz: |  Urheberrechtsschutz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie | |||||||
| Dokument erstellt am: | 15.11.2002 | |||||||
| Dateien geändert am: | 12.02.2007 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 15.11.2002 | |||||||
| Datum der Promotion: | 15.11.2002 |
