Dokument: The control of the honeybee sex determination pathway by alternative splicing

Titel:	The control of the honeybee sex determination pathway by alternative splicing
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=21549
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20120604-104422-4
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Nissen, Inga [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 7,98 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 30.05.2012 / geändert 30.05.2012
Beitragende:	Prof. Dr. Beye, Martin [Betreuer/Doktorvater] Prof. Dr. Rose, Laura [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Die Entscheidung ob sich aus einem Embryo der Honigbiene (Apis mellifera) männliche oder weibliche Tiere entwickeln, wird im Rahmen der Geschlechtsdeterminationskaskade gefällt, in die die Gene complementary sex determiner (csd), feminizer (fem) und Am-doublesex (Am-dsx) involviert sind. In der vorliegenden Arbeit wurde mit Am-transformer 2 (Am-tra2) ein weiterer Spleißfaktor charakterisiert, der auch in Drosophila melanogaster eine wichtige Rolle in der Geschlechtsdetermination spielt. Insgesamt sechs geschlechtsunspezifische Spleißvarianten kodieren für Isoformen des SR-Proteins Am-Tra2, die während der gesamten Entwicklung transkribiert werden. Dabei ist die Expression im Embryo am höchsten und nimmt im pupalen Stadium ab. Alle Isoformen weisen eine RNA-Bindedomäne (RBD), sowie zwei Arginin-/Serin reiche Domänen auf, die sich bei den Isoformen in der Länge unterscheiden. Die embryonale Repression der Am-tra2-Transkription über RNA-Interferenz zeigt, dass das Gen Am-tra2 sowohl für das weibchenspezifische Spleißen der fem- und Am-dsx-prä-mRNA, als auch für die Produktion des männlichen fem-Transkripts wichtig ist. Zusätzlich hat die Repression der Am-tra2-Transkription eine erhöhte embryonale Letalitätsrate zur Folge, was auf eine vitale Funktion des Gens während der Embryogenese hindeutet. Die genaue Funktion von Am-Tra2-Proteinen auf Ebene der fem-Spleißregulation ist noch ungeklärt, da Am-Tra2-Proteine sowohl zusammen mit Csd-Heteromeren als auch mit Fem-Proteinen, das weibchenspezifische Spleißen der fem-prä-mRNA vermitteln könnten. Die Bedeutung von Fem- und Am-Tra2-Proteinen für das Spleißen der Am-dsx-prä-mRNA wurde mittels eines in vivo Spleißassays in Schmetterlingszellen (Sf21-Zellen) untersucht: Die Expression eines Am-dsx Minigenkonstrukts zeigte, dass der männliche Spleißweg von Am-dsx voreingestellt ist, während Am-Tra2-Protein zusammen mit Fem-Protein für die Produktion von weiblichem Am-dsx Transkript sorgt. Im Bereich direkt vor dem weibchenspezifischen Spleißdonor von Am-dsx, befinden sich exonische spleißsteigernde Sequenzen (ESEs), die bei Koexpression von Am-Tra2- und Fem-Proteinen zur Aktivierung des Spleißdonors beitragen. Mittels Insertion von Mutationen konnten innerhalb dieses Sequenzabschnitts zwei Wiederholungen eines Hexamer-Motivs (AAAGAG) identifiziert werden, die als ESE wichtig für die Am-Tra2-/Fem-Protein abhängige Spleißdonoraktivierung sind. Diese Befunde zeigen, dass die einzelnen Faktoren des dsx-Spleißprozesses zwischen D. melanogaster und A. mellifera konserviert sind, der Mechanismus der dsx Spleißregulation jedoch evolviert ist. The decision of male or female development in the embryo of the honeybee (Apis mellifera) involves the genes complementary sex determiner (csd), feminizer (fem) and Am-doublesex (Am-dsx), which are components of the regulatory cascade of sex determination. In the present work, I characterized an additional splicing factor, Am-Tra2 protein, whose ortholog in Drosophila melanogaster has also an important function within sex determination. Six splice variants of the gene Am-tra2 are transcribed throughout development and code the SR-protein Am-Tra2. The non-sex-specific transcripts are most abundant in embryonic to larval stages. Each isoform of the Am-Tra2 proteins has two arginine/serine-rich domains of differing lengths and an RNA binding domain (RBD). Embryonic repression of Am-tra2 gene by RNA interference showed that the Am-tra2 gene has an important role in female specific splicing of both fem and Am-dsx pre-mRNAs and the production of male fem transcripts. In addition, knockdown of the Am-tra2 gene affects the viability of the embryo, suggesting that the Am-tra2 gene has an essential function in embryogenesis of the honeybee. The role of Am-Tra2 protein on the level of fem pre-mRNA splicing is still unclear, as Am-Tra2 proteins may act as putative cofactors of Csd heteromeres or of Fem proteins that mediate splicing of the fem pre-mRNAs into the productive female form. The impact of Fem and Am-Tra2 proteins in Am-dsx pre-mRNA splicing was examined by an in vivo splice assay in lepidopteran cells (Sf21-cells). The expression of an Am-dsx mini gene showed, that male splicing of the Am-dsx pre-mRNA is the default state, whereas Am-Tra2 and Fem proteins direct together female specific Am-dsx splicing. The sequence directly upstream of the female specific splice donor site contains exonic splice enhancer sequences (ESEs) that are involved in the activation of the splice donor in presence of Fem and Am-Tra2 proteins. By introducing mutations within this sequence we identified two hexamer repeats (AAAGAG) that are important for the Fem/Am-Tra2 protein mediated splice donor activation. These findings suggest that the components which are involved in dsx pre-mRNA splicing are conserved between D. melanogaster and A. mellifera, while the underlying mechanism of producing the sex-specific dsx transcripts has evolved.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » Genetik
Dokument erstellt am:	04.06.2012
Dateien geändert am:	04.06.2012
Promotionsantrag am:	23.03.2012
Datum der Promotion:	20.04.2012