Dokument: Resistance against Oxidative Glutamate Toxicity: Functional Characterization of Amino Acid Antiporter Subunit xCT, Purinergic ATP Receptor P2X3 and Mitochondrial Fission Factor GDAP1

Titel:	Resistance against Oxidative Glutamate Toxicity: Functional Characterization of Amino Acid Antiporter Subunit xCT, Purinergic ATP Receptor P2X3 and Mitochondrial Fission Factor GDAP1
Weiterer Titel:	Resistenz gegenüber Oxidativer Glutamattoxizität: Funktionelle Charakterisierung der Aminosäure-Antiporter-Untereinheit xCT, des Purinergen ATP-Rezeptors P2X3 und des Mitochondrialen Fragmentierungs-Faktor GDAP1
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=21539
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20120604-145101-7
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Noack, Rebecca [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 3,95 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 29.05.2012 / geändert 29.05.2012
Beitragende:	Prof. Dr. Methner, Axel [Gutachter] Prof. Dr. Willbold, Dieter [Gutachter]
Stichwörter:	Oxidative glutamate toxicity, xCT, Ganglioside-induced differentiation protein 1 (GDAP1), Charcot-Marie-Tooth disease (CMT), mitochondrial fission
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Oxidative stress is involved in neurodegenerative diseases. High glutamate concentrations lead to a cell death program distinct from excitotoxicity called oxidative glutamate toxicity. Here, excessive extracellular glutamate blocks the activity of the cystine/glutamate antiporter system Xc- resulting in depletion of the important antioxidant glutathione (GSH), increased levels of reactive oxygen species (ROS), the activation of 12/15-lipoxygenase (12/15-LOX), and the opening of cyclic guanosine monophosphate (cGMP)-gated Ca2+ channels. The hippocampal cell line HT22 is an excellent model to study oxidative glutamate toxicity as it lacks ionotropic glutamate receptors. Furthermore, a glutamate-resistant cell line (HT22R) has been generated providing a useful tool to identify protective proteins and pathways. HT22R cells withstand high glutamate concentrations and exhibit increased GSH and reduced ROS levels. Moreover, they differ from glutamate-sensitive HT22 cells at the transcriptional level. Affymetrix array analysis identified several transcripts, including those for xCT, the functional subunit of Xc-, the ionotropic P2X receptor P2X3, and the mitochondrial protein Ganglioside-induced differentiation protein 1 (GDAP1), which were further analyzed in this study. xCT remarkably protected HT22 cells against glutamate toxicity by elevating cellular GSH concentration, which was confirmed by cell death assays with the GSH precursor N-acetyl-L-cysteine. Both xCT silencing and pharmacological inhibition increased the susceptibility of HT22R cells to glutamate and reduced elevated GSH levels indicating that the upregulation of xCT accounts to a large part for the protective phenotype of HT22R cells. Preliminary experiments further indicated a role of xCT in cell differentiation, inflammation, and ischemic stroke. Despite the high upregulation of P2X receptors P2X3 and P2X7 in HT22R cells, their overexpression did not result in protection against oxidative glutamate toxicity. These factors were therefore not further analyzed. GDAP1 is a mitochondrial protein and fission factor. Mutations in GDAP1 cause the hereditary peripheral neuropathy Charcot-Marie-Tooth disease CMT4A. GDAP1 overexpression protected HT22 cells against glutamate toxicity and NSC-34 motor neuron cells against buthionine sulfoximine (BSO)-induced glutathione depletion. Moreover, GDAP1 rescued HT22 cells from cell death induced by overexpression of 12/15-LOX and truncated Bid. Increased GDAP1 expression caused an increase in the mitochondrial membrane potential (Ψm) suggesting high respiratory capacities. At the same time, a GDAP1-induced shift in energy metabolism towards glycolysis was observed together with an increase of the expression of hexokinase-2 and its binding to mitochondria - phenotypes that resemble the Warburg effect, namely elevated glycolysis in the presence of oxygen, a main feature of cancer cells. On the other hand, GDAP1 increased the expression and activity of the mitochondrial complex II or succinate dehydrogenase, but the effect on oxidative phosphorylation was not further studied. The disease-associated point mutation R310Q attenuated some of the functions of GDAP1, including mitochondrial fission, protection against glutamate- and BSO-induced cell death, and the increase of Ψm and complex II activity. Furthermore, fibroblasts derived from two CMT4A patients exhibited reduced Ψm and complex II activities suggesting that, in addition to the impairment of mitochondrial fission, deficiencies in energy production account for the pathology of CMT4A. Taken together, these results prove the involvement of oxidative stress in the pathogenesis of CMT4A, a hereditary neurodegenerative disease. Oxidativer Stress spielt bei verschiedenen Krankheiten und auch bei neurodegenerativen Krankheiten eine wichtige Rolle. Hohe Glutamatkonzentrationen führen zu oxidativer Glutamattoxizität, einem Zelltodprogramm, das sich von Exzitotoxizität unterscheidet. Extrazelluläres Glutamat führt hier zu einer Hemmung der Aufnahme der Aminosäure Zystin durch das Glutamat-Zystin-Antiporter-System Xc-. Zystin wird zur Synthese des wichtigen intrazellulären Antioxidanz Glutathion benötigt. Ein Absinken des Glutathion-Spiegels führt zu einem Anstieg in der Konzentration reaktiver Sauerstoffspezies, der Aktivierung von 12/15-Lipoxygenase (12/15-LOX) sowie dem Öffnen cGMP-gesteuerter Kalziumkanäle. Die hippokampale HT22-Zellline besitzt keine ionotropen Glutamatrezeptoren und ist daher ein hervorragendes Modell zur Untersuchung von oxidativer Glutamattoxizität. Die glutamat-resistente Zelllinie HT22R stellt ein weiteres Werkzeug zu Identifizierung protektiver Faktoren dar. HT22R-Zellen überleben hohe Glutamatkonzentrationen, besitzen erhöhte Glutathionspiegel sowie verringerte Konzentrationen reaktiver Sauerstoffspezies und unterscheiden sich in ihrem Transkriptom von glutamat-sensitiven HT22-Zellen. Mithilfe einer Arrayanalyse konnten verschiedene Transkripte identifiziert werden, unter anderem die für die regulatorische Xc--Untereinheit xCT, den P2X-Rezeptor P2X3 und das mitochondriale Protein GDAP1. Ziel dieser Arbeit war, die zelluläre Funktion und insbesondere den Schutz dieser Faktoren vor oxidativem Stress zu untersuchen. xCT-Überexpression schützte HT22-Zellen erheblich gegen oxidative Glutamattoxizität, während xCT-Knockdown und pharmakologische Inhibierung die Resistenz gegen oxidativen Stress verminderten. Erste Ergebnisse belegten weiterhin eine Rolle für xCT bei der Zelldifferenzierung, während Entzündungsprozessen und beim Schlaganfall. P2X3 und ein weiterer P2X-Rezeptor, P2X7, waren in HT22R-Zellen stark hochreguliert. Trotzdem konnte ihre Überexpression nicht vor oxidativer Glutamattoxizität schützen. Da hier protektive Faktoren analysiert werden sollten, wurden P2X3 und P2X7 nicht weiter untersucht. GDAP1 ist ein mitochondriales Protein und spielt eine Rolle bei der Fragmentierung von Mitochondrien. Mutationen im Gen für GDAP1 verursachen die autosomal-rezessive Charcot-Marie-Tooth-Erkrankung 4A. Überexpression von GDAP1 schützte vor Glutamat- und Buthioninsulfoximin (BSO)-induziertem oxidativen Stress sowie vor Zelltod, der durch die Aktivität von 12/15-LOX und tBid verursacht wurde. GDAP1 erhöhte das mitochondriale Membranpotenzial und somit die Kapazität für oxidative Phosphorylierung. Zur gleichen Zeit wurden eine erhöhte Glykolyserate sowie eine erhöhte Expression der Hexokinase-2 sowie deren Bindung an Mitochondrien beobachtet. Dies sind Effekte, die beim Warburg-Effekt (erhöhte Glykolyserate trotz Sauerstoff) in Krebszellen auftreten. Auf der anderen Seite erhöhte GDAP1 die Expression und Aktivität des mitochondrialen Komplexes II, auch Succinat-Dehydrogenase genannt. Die krankheitsverursachende Punktmutation R310Q hob einige der Funktionen von GDAP1 auf, unter anderem die mitochondriale Fragmentierung, den Schutz gegen oxidative Glutamattoxizität, die Erhöhung des mitochondrialen Membranpotenzials sowie die Steigerung der Succinat-Dehydrogenase-Aktivität. Außerdem zeigten Fibroblasten von CMT4A-Patienten verringerte mitochondriale Membranpotenziale und Succinat-Dehydrogenase-Aktivitäten. Dies weist darauf hin, dass neben der Beeinträchtigung der mitochondrialen Fragmentierung auch Defekte in der zellulären Energiegewinnung eine Rolle in der Entstehung der Charcot-Marie-Tooth-Erkrankung spielen. Zusammenfassend zeigen diese Ergebnisse, das oxidativer Stress eine wichtige Rolle bei neurodegenerativen Erkrankungen spielt.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät
Dokument erstellt am:	04.06.2012
Dateien geändert am:	04.06.2012
Promotionsantrag am:	31.03.2011
Datum der Promotion:	08.06.2012