Dokument:
Die Peptidamidase aus Stenotrophomonas
maltophilia:
Molekulargenetische, biochemische, strukturelle und mechanistische
Charakterisierung sowie biotechnologischer Einsatz
| Titel: | Die Peptidamidase aus Stenotrophomonas maltophilia: Molekulargenetische, biochemische, strukturelle und mechanistische Charakterisierung sowie biotechnologischer Einsatz | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=2146 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20020708-000146-4 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Deutsch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Neumann, Sebastian [Autor] | |||||||
| Dateien: |
| |||||||
| Beitragende: | Prof. Dr. Kula, Maria-Regina [Gutachter] Prof. Dr. Büldt, Georg [Gutachter] Prof. Dr. Schomburg, Dietmar [Gutachter] | |||||||
| Stichwörter: | Stenotrophomonas maltophilia,Peptidamidase, Amidase-Signatur-Familie, Kristallisation, Strukturanalyse,Katalysemechanismus, Charakterisierung, gerichtete Mutagenese, organischeLösungsmittel, ionische FlüssigkeitenStenotrophomonas maltophilia, peptidase amidase,amidase signature family, crystallisation, structure,catalytic mechanism, characterisation, directed mutagenesis, organicsolvents, ionic liquids | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie | |||||||
| Beschreibung: | Peptidamidasen (Peptidamid-Amidohydrolasen) hydrolysieren spezifisch die
C-terminale Amidgruppe in Peptidamiden. Bisher sind pflanzliche und
bakterielle Peptidamidasen bekannt.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde aus der N-terminalen
Sequenzinformation der Peptidamidase (Pam) aus Stenotrophomonas
maltophilia eine 45 Nukleotide umfassende Gensonde abgeleitet. Mit Hilfe
dieser Gensonde wurde ein 6,9 kb-BglII-DNA-Fragment aus einer partiellen
Genbank isoliert, auf dem sich neben fünf weiteren hypothetischen
Genen das vollständige Peptida-midase-Gen befindet. Die
Sequenzanalyse ergab, dass das Peptidamidase-Gen monocistronisch
organisiert ist, eine Signalsequenz aufweist und dass es sich bei dem
Genprodukt weiterhin um ein Mitglied der Amidase-Signatur-Familie
handelt. Von der Pam-Variante 6, die keine N-terminale Signalsequenz,
aber einen C-terminalen His6-Tag aufweist, konnten nach Fermentation im
12-Liter-Maßstab und einer Zwei-Schritt-Aufreinigung insgesamt 2,1
g zu über 95% reines Enzym für die weiteren Experimente
bereitgestellt werden. Es folgte die umfassende biochemische Charakterisierung der rekombinanten Pam bezüglich der Lagerungsstabilität, des nativen Molekulargewichtes (ca. 50 kDa), des isoelektrischen Punktes (6,3), der Quantifizierung der Sulfhydrylgruppen, des Substratspektrums, der Substratkinetiken, des Temperaturoptimums (50-54°C), des pH-Optimums (7,0-8,2) und der Empfindlichkeit gegenüber verschiedenen Inhibitoren. Das Dipeptidamid Ala-Phe-NH2 wird mit einer spezifischen Aktivität von 194,3 U/mg und einem KM-Wert < 0,5 mM zu Ala-Phe-OH hydrolysiert. Chymostatin wurde als starker Inhibitor identifiziert (KI < 0,3 mM). Die Peptidamidase wurde kristallisiert und die Kristallisationsbedingungen optimiert. Anschließend wurde die Röntgenstrukturanalyse der Peptidamidasekristalle von J. Granzin und J. Labahn am Institut für Biologische Informationsverarbeitung 2 im Forschungszentrum Jülich durchgeführt. Die Lösung des Phasenproblems gelang mittels isomorpher Substitution. Die Struktur der nativen Peptidamidase wurde bei einer Auflösung von 1,4 Å bestimmt, damit wurde erstmalig die Struktur eines Mitglieds der etwa 240 Mitglieder umfassenden Amidase-Signatur-Familie aufgeklärt. Darüber hinaus konnte die Struktur des Peptidamidase-Chymostatin-Komplexes bei einer Auflösung von 1,8 Å ermittelt werden. Auf der Grundlage der Strukturdaten wurde anschließend eine gerichtete Mutagenese von Aminosäu-reresten im aktiven Zentrum durchgeführt. Ziel war es, die Funktion der Aminosäurereste zu klären. Die fünf erzeugten Peptidamidase-Varianten wurden kinetisch charakterisiert. Die in der vorliegenden Arbeit erhobenen Daten widersprechen dem bisher angenommenen Kataly-semechanismus einer Ser-Lys-Diade für Amidase-Signatur-Enzyme. Auf der Grundlage der Struk-turdaten des Enzym-Inhibitor-Komplexes, der Ergebnisse der gerichteten Mutagenese und der Inhibitionsstudien wurde ein abweichender Reaktionsmechanismus vorgeschlagen. Die Rolle des Ser-226 als primäres Nucleophil wird zwar bestätigt, Lys-123 kann allerdings im Fall von Pam nicht unmittelbar als generelle Base fungieren, die das Nucleophil aktiviert, da die räumliche Nähe zu Ser-226 nicht gegeben ist. Die Strukturdaten legen darüber hinaus nahe, dass Lys-123 im Fall von Pam nicht als generelle Base fungieren kann, da der Rest vermutlich protoniert vorliegt. Bei Untersuchungen zur biotechnologischen Anwendung der Peptidamidase aus S. maltophilia zur Synthese von Peptidamiden aus Peptiden und Ammonium wurde der Einsatz des Enzyms in organi-schen Lösungsmitteln und ionischen Flüssigkeiten in Gegenwart von 0 bzw. 3% Wasser untersucht. In einem Gemisch aus organischen Lösungsmitteln konnte eine Ausbeute von 30% erreicht werden. Die Umsetzung in ionischen Flüssigkeiten führte zu einer Ausbeute von 20%. | |||||||
| Lizenz: |  Urheberrechtsschutz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie | |||||||
| Dokument erstellt am: | 08.07.2002 | |||||||
| Dateien geändert am: | 12.02.2007 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 08.07.2002 | |||||||
| Datum der Promotion: | 08.07.2002 |
