Dokument: AXOTOMY-INDUCED GENE EXPRESSION IN RAT BRAIN

Titel:	AXOTOMY-INDUCED GENE EXPRESSION IN RAT BRAIN
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=2138
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20011116-000138-8
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Abankwa, Daniel [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 3,79 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 09.02.2007 / geändert 09.02.2007
Beitragende:	Prof. Dr. Müller, Hans Werner [Gutachter] Prof. Dr. Weiss, Hanns [Gutachter]
Stichwörter:	Zentralnervensystem, Regeneration, Axotomie, DNA Array, Genexpress ioncentral nervous system, regeneration, axotomy, DNA array, gene expression
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Axotomierte ZNS Neurone regenerieren nicht spontan. Stattdessen beobachtet man nur abortives axonales Auswachsen bis zum Läsionsort. Die Gründe für diese limitierte Auswachskapazität sind immernoch unbekannt. Der distal transektierte Fornix der adulten Ratte stellt ein experimentelles Axotomie-Modell dar, an Hand dessen man Axotomie induzierte Reaktionen untersuchen kann. Dieses ZNS Läsions Paradigma wurde verwendet, um in Teil A die induzierten molekularen Veränderungen zu beschreiben, die über histochemische Techniken detektierbar sind. Ausserdem wird darüber berichtet, dass Injektion von 2,2\'-Dipyridyl, entgegen vorhergehender Aussagen nicht zur Regeneration führt. In Teil B wurden cDNA Arrays angewandt, um Gene zu identifizieren, die nach Axotomie im Subiculum, differenziell exprimiert wurden. Das Subiculum enthält die Projektions-Neurone des Fornix. In Teil A wird mittels Immunhistochemie und in situ Hybridisierung die Expression von Genen untersucht, über die aus anderen Läsions- Paradigmen bekannt ist, dass sie auf Axotomie reagieren können. Sowohl GAP-43, als auch L1 wurden im nicht lädierten Subiculum exprimiert. Dort blieb ihr Expressionsmuster zwischen einem Tag und vier Wochen nach der Axotomie unverändert. Das gleiche galt für die Calcium bindenden Proteine Calbindin d28 und Parvalbumin, die zu den Zeitpunkten zwei und drei Wochen nach Fornix Transektion untersucht wurden, ebenso wie für den Transkriptionsfaktor Sox-10 und die Metalloprotease rMDC15. Diese letzten beiden Gene wurden auch am Läsionsort exprimiert, jedoch war nur Sox-10 heraufreguliert in der Region, in der die Axone auch degenerierten. Des weiteren wurden GAP-43 und L1 im Fornix-Stumpf untersucht, da sie bekanntlich schnell anterograd im Axon transportiert werden. Zusätzlich wurde der Degenerations-Marker Clusterin verwandt, um die Ausdehnung degenerativer Bereiche zu beschreiben. Die GAP-43- und L1-Immunreaktivität war in einem schmalen Streifen im proximalen Stumpf erhöht. Zu späteren Zeitpunkten nach Axotomie war die Expression von L1, Clusterin und Sox-10 in degenerierenden Segmenten des Fornix erhöht. Die beobachteten molekularen Veränderungen legen nahe, dass die Expression der untersuchten Gene im Subiculum unverändert blieb. Ausserdem halfen die Expressions-Daten aus dem proximalen Stumpf die räumliche und zeitliche Ausdehnung degenerativer und regenerativer Ereignisse im Fornix zu bestimmen. In Teil B dieser Arbeit wurden cDNA Arrays mit etwa 3% des Ratten-Genoms verwandt, um die transkriptionellen Veränderungen im Subiculum nach Axotomie zu charakterisieren. Datensätze von Kontrolltieren wurden mit solchen verglichen, die von Tieren stammten, die (i) beginnende Degeneration bei 1 Tag, (ii) axonales Auswachsen bei 7 Tagen und (iii) axonalen Wachstumsstop am Läsionort bei 3 Wochen nach Fornix-Transektion zeigten. Zur Auswertung wurde ein auf Microsoft Excel basierendes Analyse-Programm entwickelt, welches die Normalisierung der Rohdaten, differenzielle Analyse und Identifizierung hochreproduzierter Gene erlaubte. Von 1185 untersuchten Genen wurden 174 identifiziert, die nach Axotomie des postcommissuralen Fornix differenziell im Subiculum exprimiert wurden. Von diesen Genen wurden 29, 19 und 17 regulierte Gene bei den Zuständen (i), (ii) beziehungsweise (iii) identifiziert. Der Gesamtvergleich aller regulierter Gene zeigte, dass die Zustände (i) - (iii) drei spezifische Genexpressionsmuster haben, wobei Zustände (i) und (iii) 18 Gene (etwa 10% der identifizierten) gemeinsam hatten. Unter diesen Genen waren einige, die funktionell z.B. mit dem Proteasom, kleinen GTPasen, G Proteinen oder dem Cytoskelett assoziert sind. Dies legt Ihre Bedeutung für die zelluläre Antwort nach Axotomie nahe. Dieser Genomics-Ansatz erlaubt eine vorsichtige Schätzung der Gesamtzahl Axotomie-induzierter neuraler Gene. Die Tatsache, dass das Expressionsmuster aus dem Zustands (ii), dem axonalen Auswachsen, dynamisch in (iii) Wachstumsstop an der Läsionsstelle wechselt, wirft die Frage auf, ob molekulare Signale retrograd von der Läsionstelle aus das Expressionmuster verändern. Axotomized CNS neurons do not regenerate spontaneously. Instead, only abortive axon outgrowth up to the lesion site is observed. The reasons for this limited outgrowth capacity are still unknown. The distal transection of the fornix of the adult rat provides an experimental axotomy model, which allows the investigation of axotomy induced responses. Using this CNS lesion paradigm, part A of this thesis describes the induced molecular changes, which could be detected with histochemical techniques. In addition, the regeneration failure after immediate 2,2\'-dipyridyl injection is reported. In part B, cDNA arrays were applied to identify genes, which were differentially expressed within the subiculum upon axotomy, the part of the brain, which contains the projecting neurons of the fornix. In part A, immunohistochemistry and in situ hybridization were used to study the expression of genes, which were known to be responsive in other axotomy paradigms. Both, GAP-43 and L1 were expressed in the unlesioned subiculum, and their expression pattern was not changed between one day and four weeks after axotomy. The same was true for the calcium binding proteins calbindin d28 and parvalbumin, which were studied at two and three weeks after fornix transection, and also for the transcription factor Sox-10 and the metalloprotease rMDC15. The latter two genes were also expressed at the lesion site upon axotomy, but only Sox-10 was increased in areas, where the axons degenerated. In addition, GAP-43 and L1 were studied in the fornix stumps, as they were known to be fast anterogradely transported in the axons. Furthermore, the degeneration marker protein clusterin was used to describe the extension of degenerative events. GAP-43 and L1 immunolabeling was found to be increased in the proximal fornix stump in a small ribbon like structure. At later times after axotomy, the expression of L1, clusterin and Sox-10 were found to be increased in degenerating segments of the fornix. The observed molecular changes suggested, that the expression of the genes studied in the subiculum remained unaltered. Moreover, the expression data within the proximal stump and at the lesion site helped to describe the spatio-temporal extension of the degenerative and regenerative events within the fornix. In part B of this thesis, cDNA arrays were employed to characterize the transcriptional changes within the subiculum upon axotomy on a scale of about 3% of the rat genome. Datasets of sham operated controls were compared to animals displaying (i) degeneration onset at 1 day, (ii) axonal outgrowth at 7 days and (iii) axon outgrowth arrest at the lesion site at 3 weeks after fornix transection. Therefore, a Microsoft Excel based analysis program was developed, which performed normalization of raw data, differential analysis and identification of genes, which were highly reproduced. Out of 1185 studied genes 174 were identified to be differentially expressed in the subiculum after axotomy of the postcommissural fornix. Out of these genes, 29, 19 and 17 regulated genes were identified to be highly reproducible at stages (i), (ii) and (iii), respectively. The overall comparison of the regulated genes at stages (i) - (iii) revealed three specific gene expression patterns, but with stages (i) and (iii) sharing 18 (about 10% of all identified) genes. Among these genes were some, which are known to be functionally associated, e.g. with the proteasome, small GTPases, G proteins or the cytoskeleton, suggesting their importance in the cellular response after axotomy. This genomics approach provides a cautious estimation for the total number of responsive neural genes following axotomy. In addition, it could be shown that the expression pattern during (ii) axonal outgrowth is dynamically changed upon (iii) growth arrest at the lesion site, which raises the question whether feedback mechanisms act retrogradely from the lesion site to change the expression pattern. Further analysis of identified putative pathways, which could be responsible for axon outgrowth, may provide a completely new basis for the development of new therapies, which might preferentially act on the neuron after axon transection in the CNS.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie
Dokument erstellt am:	16.11.2001
Dateien geändert am:	12.02.2007
Promotionsantrag am:	16.11.2001
Datum der Promotion:	16.11.2001