Dokument: Identifizierung und Charakterisierung potentieller neuer Effektorproteine aus Chlamydia pneumoniae

Titel:	Identifizierung und Charakterisierung potentieller neuer Effektorproteine aus Chlamydia pneumoniae
Weiterer Titel:	Identification and characterization of potential new effector proteins of Chlamydia pneumoniae
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=21196
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20120412-091043-7
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Dr. rer. nat. Herbst, Frauke [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 15,65 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 11.04.2012 / geändert 11.04.2012
Beitragende:	Prof. Dr. Hegemann, J. H. [Gutachter] Prof. Dr. Aberle, Hermann [Gutachter]
Stichwörter:	Chlamydien Infektion Inc-Protein Inklusionsmembran Effektorprotein
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Chlamydien sind obligat intrazelluläre, gram-negative Bakterien. Zu den humanpathogenen Chlamydien gehören Chlamydia trachomatis, Chlamydia pneumoniae und Chlamydia psittaci. C. trachomatis ist der Hauptauslöser sexuell übertragbarer Erkrankungen, die bei Frauen zu Infertilität führen können, verursacht andererseits aber auch eine Augeninfektion, die unbehandelt zu Erblindung führt und vor allem in Entwicklungsländern ein schwerwiegendes Problem darstellt. C. psittaci, Auslöser der Psittakose, ist ein zoonotischer Erreger grippeähnlicher Erkrankungen mit teils tödlichem Ausgang. C. pneumoniae infiziert die oberen Atemwege und führt zu Bronchitis und Pneumonien, wird aber auch mit systemischen Erkrankungen in Zusammenhang gebracht. Chlamydien zeichnen sich durch einen einzigartigen, biphasischen Lebenszyklus aus und verbleiben während der gesamten intrazellulären Entwicklung in einer parasitophoren Vakuole, der so genannten Inklusion. Um intrazellulär überleben zu können, modulieren Chlamydien in vielerlei Hinsicht die Wirtszelle. Hierfür sekretieren die Bakterien Effektorproteine über den Typ III-Sekretionsapparat in die Wirtszelle und in die Inklusionsmembran, um zum Beispiel die Internalisierung zu erleichtern, eine Fusion der Inklusion mit Lysosomen zu verhindern, oder die Apoptose der Wirtszelle zu unterdrücken. Jedoch sind bis heute nur wenige Effektorproteine und ihre Funktion bekannt. Die Tatsache, dass Chlamydien bisher nicht genetisch manipulierbar sind, erschwert die Suche nach solchen Virulenzfaktoren. Ziel dieser Arbeit war es daher, in einer genomweiten Suche neue Effektorproteine zu identifizieren und zu charakterisieren. Hierzu wurde in Zusammenarbeit mit Frau Dr. Anne Kerres eine C. pneumoniae-Genom-Bibliothek in der Hefe Saccharomyces cerevisiae exprimiert und gezielt nach Proteinen gesucht, die in der Hefe zum Zelltod führen. Es ist bekannt, dass Effektoren, die konservierte eukaryotische Zielstrukturen angreifen, bei Expression in der Bäckerhefe zu einem Wachstumsdefekt führen können. Mit einer 33fachen genomischen Abdeckung konnten 47 unterschiedliche chlamydiale Leserahmen identifiziert werden, deren Lokalisierung und Phänotyp in Hefe genauer analysiert wurde. Bei 29 dieser Kandidaten handelte es sich um hypothetische Proteine. 15 Kandidaten waren als potentielle Inklusionsmembran-Proteine vorhergesagt. Drei der identifizierten Proteine waren zuvor als sekretierte Effektoren beschrieben. Aufgrund der gewonnenen Daten aus Hefe, bioinformatischer Analysen und Vergleich mit den Sekretionsvorhersagen anderer Arbeitsgruppen wurden von diesen Kandidaten sechs Proteine ausgewählt, gegen die Antiseren generiert wurden, um ihre Lokalisierung und Funktion in der Infektion genauer zu studieren. Fünf der Kandidaten zeigten eine Lokalisierung innerhalb der Inklusion. Bei vier dieser Kandidaten liegt wahrscheinlich eine Assoziation mit den Bakterien vor, wobei für zwei dieser Proteine eine Funktion in der frühen 4 Infektion postuliert werden kann. Der fünfte Kandidat könnte mit der Inklusionsmembran in Verbindung stehen. Für den sechsten Kandidaten, CPn0147, konnte eine Lokalisierung in der Inklusionsmembran gefunden werden. Des Weiteren lokalisierte dieses chlamydiale Inklusionsmembran-Protein in fadenartigen Strukturen, die von der Inklusionsmembran in das Zytoplasma der Wirtszelle reichten und meistens in der Nähe des Zellkerns zu finden waren. In der späten Infektion nahm das Auftreten dieser Fäden signifikant zu, hier konnte bei fast 50 % der Inklusionen mindestens ein Faden beobachtet werden. Interessanterweise konnten auf diesen Fäden und in der direkten Umgebung der Inklusion Lipidtröpfchen (LT) gefunden werden, auf deren Oberfläche CPn0147 lokalisierte, was auch biochemisch bestätigt werden konnte. Die Stimulation der LT-Bildung durch Ölsäure führte zu einer Steigerung der Fadenanzahl der Inklusionen vor allem in der späten Infektion. Lipidtröpfchen sind essentiell für die Entwicklung der Bakterien. Mit CPn0147 konnte erstmals ein chlamydiales Protein identifiziert werden, welches während der Infektion auf der Oberfläche von Lipidtröpfchen zu finden ist und sehr wahrscheinlich eine Rolle in der Rekrutierung dieser Organellen zur Inklusion spielt. Chlamydiaceae are obligate intracellular Gram-negative bacteria. Chlamydia trachomatis, Chlamydia pneumoniae and Chlamydia psittaci are the human pathogens of this family. Serovars of C. trachomatis are the leading cause for sexually transmitted diseases causing infertility in women. Other serovars induce infections of the eye, which can lead to a preventable form of blindness, a severe problem in the third world. C. psittaci, causative of the psittacosis, is a zoonotic agent of flu-like, sometimes lethal diseases. C. pneumoniae infects the upper respiratory tract inducing bronchitis and pneumonia but is also thought to cause systemic infections. Chlamydia exhibit a unique biphasic lifecycle and stay for the whole intracellular development inside a parasitophorous vacuole termed the inclusion. Chlamydia modulate the host cell in various ways to establish their intracellular life style. Therefore they secrete effector proteins via the type three secretion apparatus into the host cell and into the inclusion membrane e.g. to enhance their uptake, prevent lysosomal fusion or inhibit host cell apoptosis. To date, only few effector proteins and their functions are known and the fact that chlamydia are genetically intractable makes it even more difficult to identify these virulence factors. The goal of this work was therefore the identification and characterization of new effector proteins in a genome-wide approach. For this reason we expressed a genomic C. pneumoniae library in the yeast Saccharomyces cerevisiae and screened for yeast cell exhibiting a lethal phenotype. It is already described that effectors that target conserved eukaryotic structures lead to growth defects when expressed in yeast. With this approach we could identify 47 different chlamydial ORFs from which we analyzed the localization and phenotype in yeast in more detail. This screening was performed in close collaboration with Dr. Anne Kerres. 29 of the isolated candidates were hypothetical proteins with unknown function. For fifteen candidates a localization in the inclusion membrane was predicted. Amongst the 47 candidates were three already described secreted proteins. With the yeast data, bioinformatic searches and the comparison with secretion predictions from other working groups six candidates were chosen against which antisera were generated to study their localization and function during infection. Five of these candidates showed an intra-inclusion localization, four of them seemed to be bacteria-associated while one could be an inclusion membrane associated protein. The last candidate, CPn0147 could be localized in the inclusion membrane and in fibers extending from the inclusion membrane into the host cell cytosol where they often located in close proximity to the host cell nucleus. The abundance of these fibers increased significantly in the late stage of infection: 50 % of the inclusions could be associated with at least one fiber at late time points. Interestingly, CPn0147 could be also identified on lipid droplets (LDs) 6 close to the inclusion or on the observed fibers. The LD association could be verified biochemically. Stimulation of LD synthesis with oleic acid led to a significant increase in fiber formation at late time points of infection. Lipid droplets are essential for the chlamydial development and CPn0147 is the first chlamydial protein that could be found on LDs outside the inclusion and that is very likely playing a role in recruiting LDs to the inclusion.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » Funktionelle Genomforschung der Mikroorganismen
Dokument erstellt am:	12.04.2012
Dateien geändert am:	12.04.2012
Promotionsantrag am:	14.11.2011
Datum der Promotion:	12.12.2011