Dokument: Biochemical and Biophysical Studies on
Guanylate Cyclase Activating Protein 1, a Calcium-sensor in
Phototransduction

Titel:	Biochemical and Biophysical Studies on Guanylate Cyclase Activating Protein 1, a Calcium-sensor in Phototransduction
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=2103
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20010619-000103-6
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Hwang, Ji-Young [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 4,63 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 09.02.2007 / geändert 09.02.2007
Beitragende:	Prof. Dr. Büldt, Georg [Gutachter] Prof. Dr. Friedrich, Thorsten [Gutachter]
Stichwörter:	GCAP-1,Calcium-Bindungsprotein, Dimerization, Cystein-Mutante, Myristoylation,DTNB, SPRGCAP-1, Calcium-binding Protein, Dimerization, Cysteine Mutants,Myristoylation, DTNB, SPR
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	GCAP-1 (Guanylatzyklase aktivierendes Protein 1) ist ein 24 kDa schweres, hydrophobes Ca2+-Bindungsprotein. Es enthält drei funktionelle EF-Hand-Calcium-Bindungsmotive und wird in vivo N-terminal myristoyliert. Wildtyp GCAP-1 enthält vier Cysteinreste. Es wurden Cystein-Austauschmutanten hergestellt, um die Rolle der Cysteinreste in GCAP-1 für dessen Funktion zu klären. Diese wurden außerdem benutzt, Konformationsänderungen zu detektieren. Rekombinantes Wildtyp GCAP-1 und die Cystein-Mutanten wurden erfolgreich in E. coli überexprimiert und durch Gelfiltration und Anionenaustauschchromatographie gereinigt. GCAP-1 Mutanten mit nur einem Cystein-Austausch (Einzelmutanten) aktivierten die ROS-GC1 auf ähnliche Weise wie nichtmyristoyliertes Wildtyp GCAP-1 (halbmaximale Aktivität, IC50, = 5.5 µM und Hill-Koeffizient, n, = 0.9). Die Mutanten mit drei mutierten Cysteinresten (Dreifachmutanten) aktivierten die ROS-GC1 auf ähnliche Weise wie myristoyliertes Wildtyp GCAP-1 (IC50 = 706 nM und n = 1.6). Die Vierfach-Cystein-Mutante ähnelte in ihrer ROS-GC1 Aktivierung am meisten dem nativen GCAP-1 (IC50 = 293 nM and n = 1.7). Zusätzlich zeigte diese Mutante einen inhibitorischen Effekt auf die ROS-GC1 bei hohen [Ca2+]frei und ähnelte daher dem nativem GCAP-1. Es wurden verschiedene experimentelle Ansätze gewählt, um die Ca2+-abhänigigen Eigenschaften von GCAP-1 zu untersuchen: Komplexierung von Ca2+ mit 2 mM EGTA verursachte eine Änderung des Laufverhaltens von GCAP-1 im SDS-Gel. Während GCAP-1 in Gegenwart von Ca2+ bei 21 kDa läuft, findet man Ca2+-freies GCAP-1 bei 26 kDa. Der a-helikale Anteil in der Sekundärstruktur von nichtmyristoyliertem GCAP-1 verringerte sich in Abwesenheit von Ca2+, während er bei myristoyliertem GCAP-1 durch Ca2+-Komplexierung anstieg. GCAP-1 war in Gegenwart von Ca2+ thermisch stabiler als in Gegenwart von EGTA. In Abwesenheit von Ca2+ existierte GCAP-1 meist als Monomer, während in Anwesenheit von Ca2+ die dimere Form überwog. In Abwesenheit von Ca2+ zeigte GCAP-1 eine ausgeprägte Reaktivität gegenüber DTNB: alle vier Cysteinreste reagierten mit DTNB, während bei GCAP-1 in Anwesenheit von Ca2+ nur drei Cysteinreste exponiert waren. Mit Hilfe der Cystein-Mutanten wurde die Thiol-Reaktivität jedes einzelnen Cysteinrestes detailliert untersucht. Zuerst wurden in Anwesenheit von Ca2+ die Cysteinreste 18 und 125 exponiert, während das Cystein 29 erst langsam mit DTNB reagierte. Dagegen wurde der Cysteinrest 106 erst bei Ca2+-Komplexierung mit EGTA exponiert, in Anwesenheit von Ca2+ reagierte er nicht mit DTNB. Die Cystein-Mutanten wurden außerdem benutzt, die Interaktion zwischen GCAP-1 und der GCAP-1-Bindungsstelle der ROS-GC1 (d.h. Peptide, die die hypothetische GCAP-1-Bindungsregion darstellen) zu untersuchen. ROS-GC1 Peptide verringerten die Zugänglichkeit von zwei Cysteinresten, wenn GCAP-1 mit den Peptiden interagierte. The guanylate cyclase activating protein 1 (GCAP-1) is a hydrophobic 24 kDa, Ca2+-binding protein with three putative functional EF-hands. Native GCAP-1 contains myristate on the N-terminus in vivo and four cysteines. In order to evaluate whether the cysteines in GCAP-1 play a role in its function and can be used for monitoring conformational changes, several cysteine-exchange-mutants were constructed. Recombinant wild-type GCAP-1 and the cysteine mutants were successfully overexpressed in E. coli and purified by gel filtration and anion exchange chromatography. The single cysteine mutants of GCAP-1 activated ROS-GC1 in a similar fashion as nonmyristoylated wild-type GCAP-1 (half maximal activity, IC50, = 5.5 µM and Hill coefficient, n, = 0.9). The triple cysteine mutants of GCAP-1 activated ROS-GC1 in a similar fashion as myristoylated wild-type GCAP-1 (IC50 = 706 nM and n = 1.6). The quad cysteine mutant of GCAP-1 stimulated ROS-GC1 most similarly to native GCAP-1 (IC50 = 293 nM and n = 1.7) and also showed an inhibitory effect on ROS-GC1 in high [Ca2+]free. Several Ca2+-dependent properties of GCAP-1 were examined. On SDS-PAGE, complexing Ca2+ with 2 mM EGTA in GCAP-1 solution caused a Ca2+-dependent mobility shift of GCAP-1 from approx. 21 kDa to approx. 26 kDa. The a-helical content in the secondary structure of GCAP-1 decreased when the nonmyristoylated form was Ca2+-free and when the myristoylated form was saturated with Ca2+. Furthermore, GCAP-1 existed predominantly as a monomer in the absence of Ca2+ and as a dimer in the presence of Ca2+. Ca2+-bound GCAP-1 was the most thermally stable form, compared with Ca2+-free GCAP-1. GCAP-1 showed a pronounced reactivity towards the thiol-modifying reagent, DTNB. When EGTA was added, all four cysteines rapidly reacted with DTNB, while only three cysteines in GCAP-1 were exposed in the presence of CaCl2. Cysteine mutants of GCAP-1 were used to investigate the thiol reactivity of every single cysteine in more detail. The cysteines at position 18 and 125 were rapidly exposed in the presence of Ca2+, whereas the cysteine at position 29 slowly reacted with DTNB in the presence of Ca2+. Only the cysteine at position 106 was buried within GCAP-1 when Ca2+ was bound, and it was exposed after EGTA addition. Cysteine mutants were also used to study the interaction of GCAP-1 with target regions in ROS-GC1 (i.e. peptides representing hypothetical binding regions). ROS-GC1 peptides induced a shielding effect on two cysteines of GCAP-1, when they interacted with GCAP-1.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie
Dokument erstellt am:	19.06.2001
Dateien geändert am:	12.02.2007
Promotionsantrag am:	19.06.2001
Datum der Promotion:	19.06.2001