Dokument:
Charakterisierung des Ecdysteroidrezeptors als target für
arthropodenspezifische Insektizide
| Titel: | Charakterisierung des Ecdysteroidrezeptors als target für arthropodenspezifische Insektizide | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=2066 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20010420-000066-3 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Deutsch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Grebe, Marco [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Prof. Dr. Spindler-Barth, Margarethe [Gutachter] Prof. Dr. Ernst, Joachim F. [Gutachter] | |||||||
| Stichwörter: | Ecdysteroidrezeptor, ultraspiracle, Insektizide, Chironomus tentans Steroidhormonrezeptor, bakterielle Expression, Affinitätsreinigung, Glutathion-S-Transferase, Insektenentwicklung, Fusionsproteinecdysteroid receptor, ultraspiracle, Chironomus tentans, insect development,protein expression,purification | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie | |||||||
| Beschreibung: | Während der Insektenentwicklung werden die Häutungsprozesse der Larven als auch die Metamorphose zum adulten Tier im Wesentlichen durch Ecdysteroide reguliert. Bei der hormonellen Signaltransduktion spielt der Ecdysteroidrezeptor (EcR/USP), der als Liganden-aktivierter Transkriptionsfaktor durch Bindung an DNA die Expression Hormon-abhängiger Gene moduliert, eine zentrale Rolle. Daher wurde der Ecdysteroidrezeptor, der als Zielprotein Arthropoden-spezifischer Insektizide von Interesse ist, näher charakterisiert: (1) Hormon-resistente Subklone der epithelialen Zellinie von Chironomus tentans haben die für den Wildtyp charakteristische Ansprechbarkeit auf 20-Hydroxy-Ecdyson (20E) bzw. RH-5992 (Insektizid) verloren. In allen Klonen wird RH-5992 langsamer abgebaut als im Wildtyp. Damit kann erhöhter RH-5992-Metabolismus als Ursache der Insektizidresistenz ausgeschlossen werden. Die Konzentrationen von EcR und 'Ultraspiracle' (USP) entsprechen dem Wildtyp. Dagegen weicht in 3 Zellklonen die Phosphorylierung von USP ab. Bezüglich der Ecdysteroid-Bindung können die Klone wie folgt unterteilt werden: (A) Hormonbindung entspricht dem Wildtyp, (B) Dissoziations-Konstanten (KD) wie Wildtyp mit deutlich reduzierter Anzahl der Bindestellen, (C) Selektiver Verlust einer Bindestelle, (D) Veränderte Liganden-Spezifität, (E) Verlust der spezifischen Hormonbindung. Experimente zur Rekonstitution der Ligandenbindung mit bakteriell exprimiertem cEcR und cUSP ergaben, dass in Zellextrakten resistenter Chironomus-Klone nur durch Zugabe von gereinigtem EcR die hochaffine [3H]-Ponasteron A-Bindung des Wildtyps wieder hergestellt werden konnte. Damit wurde gezeigt, dass die Hormonresistenz auf Rezeptordefekte des EcR zurück zu führen ist. (2) Die Heterodimerisierungs-Partner EcR und USP aus Chironomus tentans wurden als GST-Fusionsproteine in Bakterien exprimiert und über Affinitäts-Chromatographie gereinigt. Ponasteron A-Bindungstests ergaben, dass mit gereinigtem cEcR/cUSP im Vergleich zu Chironomus-Zellextrakten identische Ergebnisse erhalten wurden, da sowohl die für den Wildtyp charakteristischen zwei hochaffinen Hormon-Bindestellen als auch die Liganden-Spezifitäten für 20E und RH-5992 nachgewiesen werden konnten. USP ist für die Ligandenbindung des cEcR essentiell. Durch Zugabe von Retikulozyten-Lysat (als Quelle für Cofaktoren und Hitzeschockproteine) konnte die Hormonbindung nicht gesteigert werden. Durch Verzicht auf Detergenz während der Herstellung rekombinanter Proteine war die Ausbeute an Rezeptoren sehr niedrig, aber die Funktionalität der Rezeptor-Proteine blieb mit ca. 50% erhalten. In Gelverzögerungs-Experimenten konnte gezeigt werden, dass auch zur DNA-Bindung gereinigter Rezeptoren keine weiteren Hilfsproteine erforderlich sind. Während die Spezifität der DNA-Bindung den Chironomus-Zellextrakten entspricht, ist das Ausmass der DNA-Bindung deutlich geringer. Die Abspaltung der Glutathion-S-Transferase mit Thrombin ergab, dass GST die DNA-Bindungseigenschaften der Rezeptoren verändert. (3) Die Liganden-bindenden Domänen (LBD's) von dEcR und dUSP aus Drosophila melanogaster (Wildtyp und Mutationen) wurden als Gal4-Fusionsproteine in Hefen exprimiert. Zur Ligandenbindung des dEcR ist USP nicht essentiell. Durch Zugabe von USP kann die Ecdysteroid-Bindung um den Faktor 10 gesteigert werden. Zur Hormonbindung und Dimerisierung der dEcR-LBD ist neben der vollständigen E-Domäne (inkl. Helix 12) auch der C-terminale Anteil der D-Domäne notwendig. Mutationen von Aminosäuren (AS), die eine Salzbrücke zwischen Helix 4 und Helix 12 bilden können, führen zu einer deutlichen Beeinträchtigung der Ligandenbindung des EcR, die durch Gegenwart von USP erhöht wird. Das zeigt, dass die Liganden-bindende Tasche des EcR durch Dimerisierung mit USP allosterisch modifiziert werden kann. Helix 10 ist für die Liganden-abhängige Dimerisierung wichtig. Dabei kann eine AS für beide untersuchten Rezeptorfunktionen wichtig sein. Mutationen von AS, die aufgrund von 3-dimensionalen Strukturmodellen mit dem Liganden in direkten Kontakt treten sollten, führen zu deutlich reduzierter Hormonbindung. Helix 12 der dUSP-LBD ist für die Dimerisierungs-abhängige Ligandenbindung der dEcR-LBD essentiell. Mit Mutationen in Helix 3 und 5 wurde gezeigt, dass die Liganden-bindende Tasche von dUSP die Hormonbindung des EcR beeinflussen kann. | |||||||
| Lizenz: |  Urheberrechtsschutz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie | |||||||
| Dokument erstellt am: | 20.04.2001 | |||||||
| Dateien geändert am: | 12.02.2007 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 20.04.2001 | |||||||
| Datum der Promotion: | 20.04.2001 |
