Dokument: Identifizierung und Charakterisierung von Tumorsuppressorgenen für die molekulare Prognostik von Tumoren der Ewing Sarkom Familie

Titel:	Identifizierung und Charakterisierung von Tumorsuppressorgenen für die molekulare Prognostik von Tumoren der Ewing Sarkom Familie
Weiterer Titel:	Identification and characterisation of tumor suppressor genes for the molecular prognosis of tumors from the Ewing sarcoma family
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=20600
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20120301-130206-1
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Hoffmann, Melanie [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 50,98 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 27.02.2012 / geändert 27.02.2012
Beitragende:	PD Dr. Schäfer, Karl Ludwig [Gutachter] Prof. Dr. Beye, Martin [Gutachter]
Stichwörter:	Ewing Sarkom, ESFTs, Ewing sarcoma family of tumors
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Die Diagnose eines am Ewing sarcoma family of tumors (ESFTs) erkrankten Patienten erfolgt heutzutage neben der Gewebehistologie auch mit molekularen Markern, vor allem durch den Nachweis einer partiellen Translokation des langen Arms von Chromosom 22 (22q12). Eine Prognoseeinschätzung wird dagegen bisher nur anhand von klinischen Prognosemarkern, wie dem Vorliegen von Metastasen bei Diagnose oder dem Ansprechen auf die initiale Chemotherapie getroffen. Prognostisch bedeutsame molekulare Marker wurden bislang erst wenige und auch nur bei einem Teil der ESFT Patienten entdeckt. Dementsprechend war ein Ziel dieser Arbeit, zusätzliche molekulare Prognosemarker in ESFTs zu identifizieren. Da in Zukunft vermutlich nicht nur ein einziger molekularer Marker routinemäßig bei den ESFT Tumorgeweben untersucht werden muss, war ein weiteres Ziel dieser Arbeit eine Methode zu finden und zu etablieren, die verschiedenste chromosomale Veränderungen erfasst und die sich zusätzlich auch für eine Routineuntersuchung eignet. Als geeignete Methode für die Routineuntersuchung von primären ESFT Tumorproben wurde die MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) ausgewählt, da sie schnell und günstig durchzuführen ist. Bei der Etablierung der Methode wurde durch mehrere Wiederholungen der Analyse nachgewiesen, dass die MLPA reproduzierbar Aberrationen bei ESFT Zelllinien und Tumorgeweben identifiziert. Dabei war es wichtig, frisches oder gefrorenes Untersuchungsmaterial und mehrere Kontrollproben zu verwenden. Im Vergleich mit der gut etablierten Methode der aCGH (Array comparative genomic hybridization) wurden durch die MLPA jeweils etwa 1,2-mal mehr Aberrationen bei den Zelllinien und Patientenproben gefunden. Ursache könnte das höhere Auflösungsvermögen der MLPA sein, aber ebenso könnte es sich um falsch-positive Ergebnisse handeln. In dieser Arbeit wurden daher nur Aberrationen berücksichtigt, die sowohl bei der MLPA als auch aCGH identifiziert wurden. Für die Anwendung bei Routineuntersuchungen sollten für die MLPA mehrere redundante Sonden für jedes Gen verwendet und im Einzelfall potentielle Aberrationen durch die Verwendung einer unabhängigen Methode verifiziert werden. Für die Suche nach neuen Kandidatengenen wurde die prognostisch bedeutsame und mit am häufigsten publizierte strukturelle Aberration in ESFTs, der Verlust des langen Arms von Chromosom 16 (16q) ausgewählt. Durch Vorarbeiten der Arbeitsgruppe wurde der chromosomale Bereich weiter auf Locus 16q22 bis 16q24 eingegrenzt. Da ein chromosomaler Verlust kennzeichnend für das Vorliegen von Tumorsuppressorgenen sein kann, wurde die Hypothese aufgestellt, dass sich in diesem Bereich mindestens ein prognostisch relevantes Tumorsuppressorgen befinden sollte. Als potentielle Tumorsuppressorgene beziehungsweise Prognosemarker in ESFTs wurden die Gene CDH11 (16q22) und TERF2IP (16q23) ausgewählt. Cadherin 11 ist ein Zelladhäsionsprotein, welches unter anderem eine wichtige Funktion bei der Entwicklung von Knochen bildenden Zellen (Osteoblasten) hat. Das Telomeric repeat binding factor 2 interacting protein (TERF2IP) ist ein indirekter, negativer Regulator der Länge von Telomeren. Für beide Gene wurden bei dem häufigsten primären malignen Knochentumor, dem Osteosarkom, Hinweise auf eine Tumor-repressive Wirkung gefunden. Die Eigenschaften der Gene in ESFTs wurden durch diese Arbeit zum ersten Mal untersucht. Die Charakterisierung der beiden potentiellen Prognosemarker anhand ihrer Gendosis zeigte, dass eine Aberration der Gene nur selten in primärem ESFT Tumorgewebe vorkommt. Hemizygote Deletionen von CDH11 wurden in Kombination von MLPA und aCGH bei 21 % der untersuchten Zelllinien, aber nur 9 % der Patientengewebe nachgewiesen. Für TERF2IP konnten hemizygote Deletionen bei 14 % der Zelllinien, jedoch bei keiner der untersuchten Tumorproben festgestellt werden. Eine Korrelation der Gendosis mit dem Krankheitsverlauf der ESFT Patienten konnte durch die selten auftretenden Aberrationen nicht durchgeführt werden. Somit konnte nicht geklärt werden, ob sich die Analyse der Gendosis von CDH11 oder TERF2IP für eine Prognoseabschätzung bei ESFT Patienten eignet. Weitergehende Untersuchungen zur Genexpression der Kandidatengene ergaben dagegen erste Hinweise darauf, dass die Höhe der Expression von CDH11 beziehungsweise TERF2IP mit dem Krankheitsverlauf der Patienten korrelieren könnte. So wurde das Vorliegen von Metastasen signifikant mit einer hohen CDH11 Protein Expression korreliert. Untersuchungen zur Überlebenszeit der ESFT Patienten bei hoher oder niedriger CDH11 Expression ergaben allerdings keinen signifikanten Unterschied. Bei den Patienten mit hoher CDH11 Expression war die 5-Jahres Überlebenswahrscheinlichkeit trotzdem etwas schlechter (6 % bei der Analyse der Protein Expression und 37 % bei der Analyse der RNA Expression). Für CDH11 wurde demnach eher der Hinweis auf eine Tumor-progressive Wirkung, als auf eine Tumor-repressive Wirkung gefunden. Für TERF2IP konnte das Auftreten von Rezidiven signifikant mit einer niedrigen Protein Expression korreliert werden. Die Analyse zur 5-Jahres Überlebenswahrscheinlichkeit konnte dagegen nicht abschließend bewertet werden, da sie einerseits bei einer hohen RNA Expression andererseits bei einer niedrigen Protein Expression von TERF2IP signifikant schlechter war. Somit wurde für TERF2IP eher ein Hinweis auf eine Tumor-repressive Wirkung bei ESFTs gefunden. Durch funktionelle Studien nach forcierter Überexpression wurden mögliche Auswirkungen einer veränderten Expression von CDH11 und TERF2IP auf die Physiologie von ESFT Zelllinien in Kultur untersucht. Bei einer CDH11 Überexpression wies die Zelllinie CHP-100 eine deutlich veränderte Morphologie und ein späteres Ablösen der Zellen bei der Kultivierung auf. Zusätzlich konnte ein Wachstumsvorteil der CDH11 Transfektante in Serum-freiem Medium nachgewiesen werden. Untersuchungen zur Aggregationsfähigkeit der Zellen ergaben ebenfalls einen sichtbaren Unterschied zwischen den CDH11 transfizierten Zellen und den Kontrollen, der aber nicht quantifizierbar war. Bei einer TERF2IP Überexpression konnten bei der Zelllinie VH-64 keine Veränderungen in der Morphologie, der Proliferation oder Aggregation festgestellt werden. Dass der Anteil an TERF2IP exprimierenden Zellen zu gering war, um quantifizierbare Veränderungen der Zellen auszulösen, konnte dabei nicht ausgeschlossen werden. Die Untersuchungen dieser Arbeit haben gezeigt, dass die Methode der MLPA durch die hohe Reproduzierbarkeit und einfache Untersuchung vieler verschiedener Gene für Routineuntersuchungen bei ESFT Patientengeweben geeignet ist. In Zukunft wäre es also möglich eine Vielzahl von molekularen Markern mit der MLPA auf Gendosisveränderungen zu untersuchen und damit dazu beizutragen Diagnose, Prognose und Therapie der ESFT Patienten zu verbessern. Für die beiden Kandidatengene CDH11 und TERF2IP konnte eine Eignung als molekulare Marker für die MLPA nicht abschließend nachgewiesen werden. Allerdings wurden durch Analysen zur Genexpression für CDH11 Hinweise auf eine Tumor-progressive Wirkung und für TERF2IP Hinweise auf eine Tumor-repressive Wirkung bei ESFT Patienten gefunden. Zusätzlich wurden bei Überexpression von CDH11 Veränderungen der Morphologie, Proliferation und Aggregation von CHP-100 Zellen gefunden. Damit qualifiziert sich CDH11 als potentieller Prognosemarker in ESFTs, der in zusätzlichen Untersuchungen weiter analysiert werden sollte. Diagnosis of patients suffering from Ewing sarcoma family of tumors (ESFTs) nowadays relies on the tissue histology and also on molecular markers, primarily by the detection of a partial translocation of the long arm of chromosome 22 (22q12). Reliable predictions of prognosis, however, are based only on clinical prognostic markers, such as the presence of metastases at diagnosis or the response to initial chemotherapy. Only few molecular markers with a prognostic significance have been discovered so far and only for a subset of ESFT patients. Accordingly, one objective of this study was to identify additional prognostically relevant molecular markers in ESFTs. Since it could be necessary in the future to examine not only a single molecular marker routinely in the ESFT tumor tissues, a further goal of this work was to find and establish a method for the detection of various chromosomal changes, which in addition should be also suitable for a routine examination. The MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) was selected as a suitable method to screen primary ESFT tumor samples routinely, because it can be performed quick and cost effective. By several repetitions of the analysis it could be demonstrated that the MLPA reproducibly identified aberrations in ESFT cell lines and tumor tissues. It was important to use fresh or frozen material for the analyses and several control samples. In comparison with the well-established aCGH (Array comparative genomic hybridization) MLPA detected about 1.2 times more aberrations each in the cell lines and patient samples. The reason could be of course the higher resolution of the MLPA, but equally there could be false-positive results either. Therefore, only aberrations that were identified in both MLPA and aCGH were included in this work. For the application of MLPA in routine examinations, several redundant probes for each gene should be used and potential aberrations should be verified in case of doubt by the use of an independent method. For the search of new candidate genes the prognostically significant and most often published structural aberration in ESFTs was selected, a loss of the long arm of chromosome 16 (16q). The chromosomal region was further narrowed to locus 16q22 to 16q24 by preliminary work of the working group. Since a chromosomal loss may be characteristic for the existence of tumor suppressor genes, it was hypothesized that there should be at least one prognostically relevant tumor suppressor gene in this area. As potential tumor suppressor genes or prognostic markers in ESFTs the genes CDH11 (16q22) and TERF2IP (16q23) were selected. Cadherin 11 is a cell adhesion protein, which has an important role in the development of bone-forming cells (osteoblasts). The Telomeric repeat binding factor interacting protein 2 (TERF2IP) is an indirect negative regulator of the telomere length. For both genes the evidence of a tumor-repressive effect was found in osteosarcoma, the most common primary malignant bone tumor. This work examined for the first time the characteristics of these genes in ESFTs. The characterization of the two potential prognostic markers based on their gene dosage showed that an aberration of the genes was rarely found in primary ESFT tumor tissue. By combination of MLPA and aCGH, hemizygous deletions of CDH11 were detected for 21 % of the examined cell lines, but only for 9 % of the patient tissues. Hemizygous deletions of TERF2IP could be found for 14 % of the cell lines, but couldn’t be detected in any of the examined tumor samples. A correlation of gene dosage with the progression of ESFT patients could not be performed because of the rare occurrence of aberrations. Therefore it could not be determined whether the analysis of gene dosage of CDH11 or TERF2IP was suitable for the prognosis in ESFT patients. Further analyses on candidate gene expression provided first indications for a correlation of CDH11 or TERF2IP expression levels with the disease course of patients. Thus, the presence of metastases was significantly correlated with a high CDH11 protein expression. Studies on the survival of ESFT patients at high or low expression of CDH11, however, showed no significant differences. Nevertheless, patients with high expression of CDH11 had a poorer 5-year survival (6 % for the analysis of protein expression and 37 % for the analysis of RNA expression). Therefore it was more likely that CDH11 showed a tumor-progressive effect, than a tumor-repressive effect. The occurrence of relapses could be significantly correlated with a low protein expression of TERF2IP. The analysis of the 5-year survival could not be definitively evaluated, since it was simultaneously significantly worse at high RNA and low protein expression. Thus, for TERF2IP rather an indication of a tumor-repressive effect on ESFTs was found. Possible effects of an altered expression of CDH11 or TERF2IP for the physiology of ESFT cell lines in culture were examined by functional studies. CHP-100 cells with an over expression of CDH11 showed an obviously altered morphology and a subsequent detachment of cells during culture. In addition, a positive growth advantage of the CDH11 transfectants was detected in serum-free medium. Studies on the aggregation ability of the cells also showed a visible difference between the CDH11 transfected cells and the controls, but this was not quantifiable. VH-64 cells with an over expression of TERF2IP showed no changes in morphology, proliferation or aggregation. It could not be excluded that the proportion of cells expressing TERF2IP was too low to produce quantifiable changes in the cells. This study was able to show that the MLPA is suitable for routine examinations in ESFT patient tissues because of its high reproducibility and simple analysis of many different genes. Thus, in the future it would be possible to examine a variety of molecular markers with MLPA and thereby help to improve diagnosis, prognosis and therapy of ESFT patients. The suitability of the two candidate genes CDH11 and TERF2IP as molecular markers for MLPA could not been proven at the end. However, gene expression analyses showed some evidence that CDH11 has a tumor-progressive effect and that TERF2IP has a tumor-repressive effect on ESFT patients. In addition, over expression of CDH11 led to modifications of the morphology, proliferation and aggregation of CHP-100 cells. Thus CDH11 qualifies itself as a potential prognostic marker in ESFTs, which should be further analyzed.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Medizinische Fakultät » Institute » Institut für Pathologie
Dokument erstellt am:	01.03.2012
Dateien geändert am:	01.03.2012
Promotionsantrag am:	02.11.2011
Datum der Promotion:	23.01.2012