Dokument: Bioaktive Sekundärstoffe aus endophytischen Pilzen – Isolierung, Strukturaufklärung und Charakterisierung der biologischen Aktivität –
| Titel: | Bioaktive Sekundärstoffe aus endophytischen Pilzen – Isolierung, Strukturaufklärung und Charakterisierung der biologischen Aktivität – | |||||||
| Weiterer Titel: | Bioactive secondary metabolites from endophytic fungi - Isolation, structure elucidation and characterization of biological activity - | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=20351 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20120130-100044-5 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Deutsch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Freitas Richard, Clécia Maria [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Prof. Dr. Proksch, Peter [Gutachter] Prof. Dr. Ebel, Rainer [Gutachter] | |||||||
| Stichwörter: | Endophytische Pilze, Naturstoffe, Strukturaufklärung, Bioaktivität, endophytic fungi, natural products, structure elucidation, bioactivity | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie | |||||||
| Beschreibungen: | Zusammenfassung:
Die vorliegende Arbeit hat eine aktuelle und wichtige Fragestellung der Wirkstoffforschung zum Gegenstand: Mit den endophytischen Pilzen wurde eine bisher nur unvollständig erschlossene Quelle neuer biologisch aktiver Substanzen näher untersucht. Die Vorteile der Gewinnung neuer Wirkstoffe aus endophytischen Mikroorganismen bestehen gegenüber Makroorganismen vor allem darin, dass die Gewinnung nahezu beliebiger Substanzmengen durch Fermentierung ohne Belastung natürlicher Ressourcen möglich ist und somit das Problem des Substanznachschubs, das die Entwicklung von Naturstoffen zu Arzneistoffen bereits in vielen Fällen stark behindert hat, prinzipiell einfacher lösbar ist. Dieser Forschungszweig wird in Zukunft einen signifikanten Beitrag bei der Suche nach neuen Wirkstoffen zur Behandlung von menschlichen Krankheiten oder zur natürlichen Entgegnung von Schädlingen in der Landwirtschaft leisten, was von erheblicher ökologischer und gesellschaftlicher Relevanz sein wird. Somit stellen endophytische Pilze bei der Entwicklung neuer Arzneistoffe und anderer biologisch aktiver Substanzen besonders wertvolle Ressourcen mit wachsender Bedeutung dar. Aus diesen Gründen ist eine Intensivierung der Erforschung von Sekundärstoffen aus Endophyten besonders aussichtsreich und bildete demzufolge den Schwerpunkt dieser Dissertation. Der Sammlung von Proben aus terrestrischen Habitaten (Pflanzen und Moosen) sowie aus chinesischen Mangrovenpflanzen folgte eine Isolierung der endophytischen Pilze aus den Wirtsorganismen. Auf Basis der Biostoffverordnung und den Regeln der guten mikrobiologischen Praxis wurde dann die eindeutige Identität des Stammes festgestellt. Das nachfolgende Primärscreening diente der Ermittlung biologisch bzw. chemisch relevanter Extrakte. Das biologische Screening wurde dabei vorwiegend auf Basis des Agarplattendiffusionstests zur Ermittlung antimikrobieller und antifungaler Aktivitäten sowie des „brine shrimp assay“ zur Ermittlung zytotoxischer Wirkungen durchgeführt. Insgesamt wurden biologische sowie chemisch analytisch aussichtsreich erscheinende Extrakte aus neun Pilzstämmen zur weiteren Untersuchung ausgewählt. Nächster Schritt war dann die Isolierung biologisch aktiver Verbindungen. Die Isolierung erfolgt mittels verschiedener chromatographischer Methoden. Unter Einsatz moderner spektroskopischer Verfahren erfolgte dann die Strukturaufklärung der isolierten Naturstoffe, insbesondere mittels HPLC-UV/VIS- und LC/MS-Spektren, Abgleich mit kommerziell erhältlichen Naturstoffdatenbanken, Ion Trap-LC/MS (ESI und APCI), sowie eindimensionale (1H-, 13C-NMR, DEPT) und zweidimensionale (COSY, HMQC, HMBC, NOESY, ROESY) NMR-Experimente. Durch Fraktionierung der Extrakte und anschließende Isolierungsschritte wurden insgesamt 33 Verbindungen gewonnen und identifiziert, von denen drei neue Sekundärstoffe darstellen. Abschließend fand die biologische bzw. pharmakologische Charakterisierung der isolierten Reinsubstanzen statt, vor allem mittels Untersuchungen ihres hemmenden Potentials gegenüber der Tumorzelllinie L-5178Y (Lymphomzellen der Maus) und Proteinkinasen. Aus dem Pilz Pleurophoma cava SL-5 wurde das Chroman-4-on Derivat Aposphaerin A isoliert. Die aus dem EtOAc-Extrakt isolierte Substanz zeigte keine deutliche zytotoxische Wirkung gegenüber der Tumorzelllinie L-5178Y. Dagegen zeigte die Verbindung eine ausgeprägte Hemmwirkung auf 4 von 24 der getesteten Proteinkinasen. Aus dem Ethylacetat-Extrakt des Pilzes Penicillium chrysogenum HN-B2 konnten die bekannten Mykotoxine Terrestrinsäure, Viridicatol, Roquefortin C und Viridicatin isoliert werden. Gegenüber der Tumorzelllinie L-5178Y zeigten die isolierten Verbindungen Terrestrinsäure, Viridicatin und Viridicatol keine signifikante Wachstumshemmung. Lediglich Roquefortin C führte in dem genannten Bioassay zu einer moderaten Hemmung der L-5178Y-Zellen. Dennoch wies diese Substanz keine nennenswerte Hemmungswirkung gegen die getesteten Proteinkinasen auf. Aus dem Pilz Botryosphaeria rhodina BT-3 wurden die zwei miteinander verwandten Benzofuran-Derivate Griseofulvin und Dechlorgriseofulvin sowie das Peptid Cycloaspeptid A und das Benzodiazepin-Derivat Sclerotigenin erhalten. Auf Grund der geringen Probemenge wurde Griseofulvin, Dechlorgriseofulvin und Cycloaspeptid A nicht den Bioassays unterzogen. Sclerotigenin zeigte gegenüber den murinen Lymphomazellen eine sehr starke Wachstummhemmung, aber keine deutliche Hemmwirkung auf die Proteinkinasen. Die bekannte Verbindung Kojisäure wurde aus dem EtOAc-Extrakt des Pilzes Neurospora discreta NE-8 isoliert. Der gewonnene Metabolit wies im Test eine schwache antibakterielle Wirkung gegenüber dem gram-positiven Bakterium Bacillus subtilis auf. Die Mykotoxine Equisetin, Fusapyron und Desoxyfusapyron wurden aus Fusarium incarnatum MGC-1.3 erhalten. In den Bioaasays zeigten sowohl Fusapyron wie Desoxyfusapyron eine starke Aktivität im antifungalen Test sowie eine bedeutende antibakterielle Wirkung. Auch Equisetin zeigte eine starke antimikrobielle Wirkung allerdings lediglich gegen das gram-positive Testbakterium. Aus dem EtOAc-Extrakt des Pilzes Neurospora terricola MGC-5.1 wurden drei Isocoumarine isoliert. Es handelte sich um die Substanzen Diaportinsäure, Diaportinol und der neue Naturstoff 6-Methoxy-3-(2,4-dihydroxypentyl)-isocoumarinol. Des Weiteren wurden in demselben Extrakt bereits anhand der UV-Spektren und ESI-Massenspektren die Verbindungen Dichlordiaportin, Indol-3-carbaldehyd und p-Hydroxybenzaldehyd detektiert. Der Ethylacetat-Extrakt wurde den bisher beschriebenen antibiotischen und zytotoxischen Assays unterzogen. Der Extrakt zeigte bei den Bioassays keine biologische Aktivität. Auf Grund der geringen Probenmenge und den vorherigen negativen Ergebnissen wurden die isolierten Verbindungen nicht auf ihre Bioaktivität untersucht. Aus Xylaria sp. MGC-12.3 wurden der Ester (E)-Methyl 3-(4-methoxyphenoxy)-propenoat, die Mykotoxine Cytochalasin E und 5-Carboxymellein sowie der neue Naturstoff 1,3-Dihydro-4-hydroxy-1-(1-hydroxyethyl)-3-oxoisobenzofuran-5-carbonsäure isoliert. Die isolierten Reinsubstanzen (E)-Methyl 3-(4-methoxyphenoxy)-propenoat, Cytochalasin E und der neue Naturstoff 1,3-Dihydro-4-hydroxy-1-(1-hydroxyethyl)-3-oxoisobenzofuran-5-carbonsäure wiesen eine potente Zytotoxität gegenüber der L-5178Y-Zelllinie mit EC50-Werten ≤ 1.0 µg/ml auf. Dagegen zeigte lediglich (E)-Methyl 3-(4-methoxyphenoxy)-propenoat eine ausgeprägte Hemmungswirkung gegen die getesteten Proteinkinasen. Aus dem endophytischen Pilz Hypoxylon fragiforme BT-III.1 wurden die Mykotoxine Scytalon, 4-Hydroxyscytalon, das Antibiotikum RF-3192-C, Mitorubrinsäure, Mitorubrinol, Cytochalasin H, Orsellinsäure und der neue Naturstoff 3-Ethyl-7-methoxy-1,3-dihydro-2-benzofuran-1-on gewonnen. In Untersuchungen zur Zytotoxizität mit der L-5178Y-Zellinie wiesen die Verbindungen Cytochalasin H, RF-3192-C und 3-Ethyl-7-methoxy-1,3-dihydro-2-benzofuran-1-on eine starke antiproliferative Aktivität auf. Orsellinsäure und Mitorubrinol konnten dagegen das Wachstum der Testzellen nicht hemmen, während Mitorubrinsäure eine mäßige Aktivität aufwies. Neben den genanten Tests wurden die isolierten Reinsubstanzen RF-3192-C, Orsellinsäure, Mitorubrinsäure und Cytochalasin H ebenso hinsichtlich ihrer inhibitorischen Wirkung gegenüber Proteinkinasen untersucht. Dabei zeigten Cytochalasin H und Orsellinsäure keine ausgeprägte Aktivität; RF-3192-C und Mitorubrinsäure waren dagegen am aktivsten. Aus dem EtOAc-Extrakt des Pilzes Eurotium rubrum (BT-1) wurden die bekannten Mykotoxine Cochliodinol und Chaetomin erhalten. Beide Substanzen bewirkten im Zytotoxizitätstest eine sehr starke Hemmung des Wachstums der L-5178Y-Zelllinien. Auch beim Proteinkinaseassay zeigten beide inhibitorische Wirkungen gegenüber Proteinkinasen, wobei Chaetomin am aktivsten war.Summary: The present study is dealing with the current and important topic in the field of bioactive compounds. Endophytic fungi were subjected to in depth scrutiny since so far, they represent a hardly explored source for discovering new biologically active secondary metabolites. In general terms, endophytic microorganism have certain benefits over macroorganisms, since production of almost unlimited quantities of a given compound by fermentation in principle should be possible without harm to fragile natural resources, thereby tackling the supply issue which has hampered the development of natural products into drugs in the past on many occasions. This field of research will deliver significant contributions in the search for new agents to treat human diseases or to combat pests in agriculture by natural means, and this will be of considerable ecological and social relevance. Thus, endophytic fungi represent a particularly valuable resource of growing importance for the development of new drugs and other biologically active agents. For these reasons, research into secondary metabolites appears rewarding and consequently was in the focus of the present dissertation. Collection of samples from terrestrial habits (plants and mosses) as well as Chinese mangrove plants was followed by isolation of endophytic fungal strains from their respective host organisms. In accordance with the Ordinance on Biological Agents („Biostoffverordnung“) and the rules of Good Microbiological Laboratory Practice, the identity of any strain was established. Subsequently, a primary screening was conducted to pinpoint biologically or chemically interesting extracts. Biological screening was based mainly on agar plate diffusion assay to establish antimicrobial or antifungal activity, accompanied by the „brine shrimp assay“ to detect cytotoxic properties. In total, nine extracts were identified as biologically or chemically/analytically promising, and were selected for further investigation. The next step was the isolation of biologically active compounds. This was achieved by different chromatographic methods. Structure elucidation of individual natural products involved modern spectroscopic techniques, including HPLC-UV/VIS and LC/MS analysis, comparison of spectral properties with commercially available data bases of natural products; ion trap LC/MS (ESI and APCI), and one-dimensional (1H, 13C NMR, DEPT) as well as two-dimensional (COSY, HMQC, HMBC, NOESY, ROESY) NMR experiments. Fractionation of individual extracts and subsequent isolation efforts resulted in the a total of 33 compounds identified compounds, out of which three represent new secondary metabolites. Finally, isolated pure compounds were subjected to biological or pharmacological characterisation, especially with regard to their inhibitory potential towards the tumour cell line L-5178Y (murine lymphoma cells) and protein kinases. From the fungus Pleurophoma cava SL-5 the chroman-4-one derivative aposphaerin A was isolated. The compound which was obtained from the EtOAc extract did not display significant cytotoxic activity towards the L-5178Y tumour cell line, but exhibited pronounced inhibitory activity against 4 out of 24 protein kinases tested. From the ethyl acetate extract of the fungus Penicillium chrysogenum HN-B2, the known mycotoxins terrestric acid, viridicatol, roquefortin C and viridicatin were obtained. Terrestric acid, viridicatol, and viridicatin did not show significant inhibitory properties towards the L-5178Y tumour cell line , while in the same bioassay, roquefortin C led to a moderate growth inhibition of L-5178Y cells. However, the compound did not display relevant inhibitory properties towards the various protein kinases. The fungus Botryosphaeria rhodina BT-3 yielded two related benzofuran congeners griseofulvin and dechlorogriseofulvin in addition to the peptide cycloaspeptide A and the benzodiazepine derivative sclerotigenin. Due to the small amounts of compounds available, griseofulvin, dechlorogriseofulvin and cycloaspeptide A were not subjected to biological testing. On the other hand, sclerotigenin was found to exhibit a strong activity towards murine lymphoma cells, but was devoid of noticeable activity against protein kinases. The known compound kojic acid was isolated from the EtOAc extract of the fungus Neurospora discreta NE-8. The isolated pure compound was found to display weak antibacterial properties against the gram-positive bacterium Bacillus subtilis. The myctotoxins equisetin, fusapyrone and deoxyfusapyrone were obtained from Fusarium incarnatum MGC-1.3. When tested for biological activity, both fusapyrone and deoxyfusapyrone exhibited strong antifungal activity and a remarkable antibacterial profile. Likewise, equisetin was strongly active, albeit only towards the gram-positive test bacterium. From the EtOAc extract of the fungus Neurospora terricola MGC-5.1, three isocoumarins were isolated. This included diaportic acid, diaportinol and the new natural product 6-methoxy-3-(2,4-dihydroxypentyl)-isocoumarinol. Furthermore, in the same extract dichlorodiaportin, indole-3-carbaldehyde and p-hydroxybenzaldehyde were detected based on their UV spectra and ESI mass spectra. The ethyl acetate extract was subjected to the different assays for antibiotic and cytotoxic activity as described above, but proved inactive. Based on these negative results and due to the low yield of compounds, no further biological testing of isolated pure compounds was conducted. From Xylaria sp. MGC-12.3 the ester (E)-methyl 3-(4-methoxyphenoxy)-propenoate, the mycotoxins cytochalasin E and 5-carboxymellein as well as the new natural product 1,3-dihydro-4-hydroxy-1-(1-hydroxyethyl)-3-oxoisobenzofuran-5-carboxylic acid were isolated. The isolated pure compounds (E)-methyl 3-(4-methoxyphenoxy)-propenoate, cytochalasin E and the new natural product 1,3-dihydro-4-hydroxy-1-(1-hydroxyethyl)-3-oxoisobenzofuran-5-carboxylic acid displayed potent cytotoxicity towards the L-5178Y cell line with EC50 values ≤ 1.0 µg/ml. However, only (E)-methyl 3-(4-methoxyphenoxy)-propenoate exhibited pronounced inhibitory activity towards the various protein kinases. From the endophytic fungus Hypoxylon fragiforme BT-III.1 the mycotoxins scytalon, 4-hydroxyscytalon, the antibiotic RF-3192-C, mitorubrinic acid, mitorubrinol, cytochalasin H, orsellinic acid as well as the new natural product 3-ethyl-7-methoxy-1,3-dihydro-2-benzofuran-1-one were obtained. When assayed for cytotoxicity towards the L-5178Y cell line, cytochalasin H, RF-3192-C and 3-ethyl-7-methoxy-1,3-dihydro-2-benzofuran-1-one were found to exhibit a strong antiproliferative activity. Orsellinic acid and mitorubrinol were unable to inhibit the growth of the cells tested, while mitorubrinic acid displayed moderate activity. In addition to these tests, the pure compounds RF-3192-C, orsellinic acid, mitorubric acid and cytochalasin H were also investigated with regard to their inhibitory profiles against protein kinases. Cytochalasin H and orsellinic acid did not display pronounced activity, whereas RF-3192-C and mitorubric acid were identified as the most active compounds. From the EtOAc extract of the fungus Eurotium rubrum (BT-1) the known mycotoxins cochliodinol and chaetomin were obtained. In the cytotoxicity assay, both compounds resulted in a very strong growth inhibition of the L-5178Y cell line. Also, in the protein kinase assay both compounds proved active, with chaetomin displaying a higher degree of activity. | |||||||
| Lizenz: |  Urheberrechtsschutz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Pharmazie » Pharmazeutische Biologie und Biotechnologie | |||||||
| Dokument erstellt am: | 30.01.2012 | |||||||
| Dateien geändert am: | 30.01.2012 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 16.04.2011 | |||||||
| Datum der Promotion: | 04.11.2011 |
