Dokument: Spectroscopic and Functional Characterization of the Heme Proteins Nitrophorin 4, Nitrophorin 7, and Selected Site-Directed Mutants: Studies of Their Nitrite Reactivity and of the Ferroheme Forms
| Titel: | Spectroscopic and Functional Characterization of the Heme Proteins Nitrophorin 4, Nitrophorin 7, and Selected Site-Directed Mutants: Studies of Their Nitrite Reactivity and of the Ferroheme Forms | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=20215 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20120110-100749-6 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Englisch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | He, Chunmao [Autor] | |||||||
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| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik » 540 Chemie | |||||||
| Beschreibungen: | Hämproteine sind sehr wichtig für lebende Organismen, wo sie an verschiedenen meta-bolischen Funktionen wie Katalyse, Elektronentransfer sowie der Erkennung und dem Transport gasförmiger Moleküle beteiligt sind. Nitrophorine (NP) bilden eine Familie von Ferrihäm b-Proteinen aus dem Speichel des blutsaugenden Insekts Rhodnus prolixus. Diese Hämproteine sequestrieren und stabilisieren NO, das von der Stickstoffmonoxid-Synthase (NOS) in den Endothelialzellen der Speicheldrüsen produziert wird. Während das Insekt Blut saugt, injiziert es gleichzeitig seinen Speichel in das Gewebe des Opfers, wo das an das Häm-Eisen koordinierte NO freigesetzt wird. Es existieren mindestens fünf Isoformen innerhalb der NP-Proteinfamilie, NP1-4 und NP7. Von diesen ist NP7 am wenigsten gut untersucht, obwohl es äußerst interessant im Hinblick auf seine einzigar-tige Phospholipidmembran-Bindefähigkeit und seine, verglichen mit den anderen NP sehr verschiedene Häm-Bindestelle ist. Daher behandelt diese Arbeit insbesondere NP7, wenngleich zu Vergleichszwecken auch NP4 untersucht wurde, da es die am bes-ten charakterisierte Isoform ist und hochaufgelöste Strukturen davon existieren. Wo nö-tig, wurden sequenzspezifisch mutierte Proteinvarianten von NP4 und NP7 hergestellt und verwendet.
Erst kürzlich wurde die Hypothese aufgestellt, dass NP auch katalytische Eigenschaften besitzen. In der vorliegenden Arbeit wurde NO2– als Substrat von NP4 und NP7 in Be-tracht gezogen. Obwohl es oft vorwiegend als physiologisch unerwünschte Verbindung angesehen wird, ist NO2– in großen Mengen (500 nM – 10 µM) im menschlichen Blut-plasma und Gewebe vorhanden. Vor Kurzem wurde es als die häufigste intravaskuläre Speicherform von NO beschrieben. Nach Inkubation von NO2– mit NP4 oder NP7 bei neutralem pH wurde beobachtet, dass NO gebildet wird und das andere Produkt als NO3– identifiziert. Die Stöchiometrie wurde als die der Nitrit-Disproportionierungsreaktion bestimmt. Durch Absorptions- und EPR-Spektroskopie wurde außerdem gezeigt, dass NP4 und NP7 in Anwesenheit des NO- Reaktanden Phenyl-4,4,5,5-tetramethylamidazolin-1-oxyl-3-oxid (PTIO) als Katalysatoren dieser Reaktion wirken, da mehrere Formelumsätze möglich sind. Um den Reaktionsmechanismus zu verstehen, wurden die Ausgangskomplexe von NO2– mit NP4 und NP7 mittels UV/Vis Absorptionsspektroskopie, Resonanz-Raman- (RR-), EPR-Spektroskopie und Stopped-Flow-Kinetik untersucht. Diese Studien ergaben zu-sammen mit kristallografischen Untersuchungen von Wildtyp-NP4-NO2– einen η1-N-Bindungsmodus, wie er für die meisten NO2–-Komplexe von Ferrihäm-Modellen und -Proteinen typisch ist. In einer anderen Versuchsreihe wurde eine Proteinmutante durch Austausch von Leuzin-130 in der distalen Häm-Bindestelle von NP4 gegen eine Arginin-Seitenkette erzeugt. Verglichen mit wildtyp-NP4 zeigte diese Mutante eine sehr viel ge-ringere Reaktivität gegenüber NO2–. Der signifikanteste Unterschied dabei ist, dass das Netzwerk von Wassermolekülen, das im Wildtyp Aspartat-30 mit NO2– verbindet, in NP4(L130R) unterbrochen ist. Es wird angenommen, dass Aspartat-30 einen außerge-wöhnlich hohen pKa (5,6 – 7,4) besitzt. Daher erscheint es plausibel, dass Aspartat-30 als Protonendonor dient, der essentiell für die Nitrit-Disproportionierungsreaktion ist. Dies wird zusätzlich durch eine weitere Proteinmutante NP4(D30N), die ebenfalls eine verringerte Reaktivität gegenüber NO2– aufweist, gestützt. Überraschenderweise zeigt die Röntgenkristallstruktur von NP4(L130R), gemessen bei 100 K, eine Koordination von Arginin-130 zum Häm-Zentrum, wohingegen UV/Vis-, RR- und EPR-Spektren, die sowohl bei Raumtemperatur als auch in gefrorener Lösung auf-genommen wurden, einen sechsfach koordinierten High-Spin- (6cHS-) Häm-Komplex mit Wasser als sechstem Liganden ergaben. Durch dosisabhängige Röntgenbestrahlung von Kristallen, die mittels Mikroabsorptionsspektroskopie beobachtet wurden, konnte gezeigt werden, dass das Ferrihäm schon durch eine sehr niedrige Dosis (0.45 MGy) der Röntgenstrahlung reduziert wird. Daher wird eine Koordination von Arginin-130 an das Ferrohäm bei niedriger Temperatur vorgeschlagen, was zusätzlich durch das RR-Spektrum bei 77 K des chemisch reduzierten Proteins, unterstützt wird das ein sechs-fach koordiniertes Low-Spin- (6cLS-) Häm zeigte. NP4(L130R) ist somit das erste Bei-spiel einer Koordination von Arginin an ein Metalloporphyrin. Der FeII-Oxidationszustand der NP wurde ebenfalls untersucht. Obwohl nicht der natürli-che Oxidationszustand, rückte er vor Kurzem in den Fokus, als das FeII–CO-Derivat als isoelektronisches Modell für den {FeNO}6-Komplex herangezogen wurde, zum Beispiel in FT-IR- und Laserblitzlichtphotolyse-Experimenten. Zunächst jedoch wurde der Effekt des routinemäßig benutzten Reduktionsmittels Na2S2O4 auf die Disulfide der NP unter-sucht. Im Überschuss eingesetztes Na2S2O4 ist in der Lage, die Disulfidbrücken zu öff-nen, wie durch 13C-NMR-Spektroskopie, Reversed-Phase-Chromatographie und Mas-senspektrometrie nachgewiesen wurde. Ferro-NP4 und -NP7 und ihre NO-Komplexe wurden dann mittels UV/Vis- und RR-Spektroskopie im Detail charakterisiert. Überra-schenderweise wurde nur im Fall von NP7 beobachtet, dass die Reduktion zum Aufbre-chen der FeII–NHis–Bindung führt. Weiter wurden die Häm-Bindestellen der Proteinmut-anten NP4(D70A), NP2(V24E), NP7(E27V) und NP7(E27Q) sowie mit symmetrischem Häm rekonstituiertes NP7 charakterisiert. Wie sich dadurch herausstellte, liegt die Ursa-che für die geschwächte FeII–His60–Bindung in der dichten räumlichen Anordnung der Reste Glu27, Phe43 und His60 in der proximalen Häm-Bindestelle von NP7, wodurch ein Druck auf die Fe–N–Bindung hervorgerufen wird. Insgesamt zeigt die vorliegende Studie, dass NP4 und NP7 die ersten Beispiele von Fer-rihäm-Komplexen sind, die die NO2––Disproportionierungsreaktion bei neutralem pH ka-talysieren. Dies erweitert die ohnehin sehr umfangreiche Chemie von Häm-Modellen und -Proteinen weiter. Darüber hinaus zeigte sich die einzigartige Beschaffenheit der Häm-Bindestelle von NP7 im Aufbrechen der proximalen Fe–His–Bindung in Folge der Reduktion des Eisens zu FeII. Im Fall des Ferrohäm-Proteins lösliche Guanylylcyclase (sGC), die der wichtigste Sensor für NO in Säugern ist, bricht die FeII–His–Bindung in Folge der Bindung von NO, wodurch die Signaltransduktion eingeleitet wird. Leider steht die Struktur von sGC nicht zur Verfügung und der Mechanismus, durch den FeII–His ge-spalten wird, ist nicht vollständig verstanden. Die vorliegende Studie zeigt, dass steri-sche Spannung zusammen mit weiteren Faktoren, von denen der wichtigste sicherlich der negative trans Effekt von NO ist, eine bedeutende Rolle bei diesem Vorgang spielen mögen.Heme proteins are very important for living organisms where they are involved in all kinds of metabolic functions including catalysis, electron transfer, and gaseous molecule sensing and transportation. Nitrophorins (NPs) comprise a family of ferriheme b proteins from the saliva of the blood sucking insect Rhodnus prolixus. These heme proteins se-quester and stabilize NO that is produced from the nitric oxide synthase (NOS) present in the endothelial cells of the salivary gland. When sucking blood, the insect concomi-tantly injects the saliva into the victim’s tissue where the coordinated NO on the heme iron is released. There are at least five isoforms in the NP family, NP1-4 and NP7. Of these, NP7 is the least studied although the most exciting isoform with respect to its unique phospholipid membrane binding ability and its very different heme pocket com-pared to the other NPs. Therefore, this thesis has an emphasis on NP7. However, NP4 is also studied in comparison since it is the best characterized isoform and high resolu-tion structures are available. Where required, site-directed mutant proteins of NP4 and NP7 were engineered and applied. It was recently hypothesized that NPs may also have catalytic properties. In the present study, NO2– was considered a substrate for NP4 and NP7. Although often thought about predominantly as a physiologically undesired compound, NO2– is present in large quanti-ties (500 nM – 10 M) in the blood plasma and tissue of humans. Recently, it was pro-posed to resemble the largest intravascular storage form of NO. Upon incubation of NO2– with NP4 or NP7 at neutral pH, it was observed that NO is formed and the other product was identified as NO3–. The final stoichiometry was elucidated as the nitrite dis-proportionation reaction. It was further shown by absorbance and EPR spectroscopy that in the presence of the NO scavenger phenyl-4,4,5,5-tetramethylamidazoline-1-oxyl 3-oxide (PTIO) NP4 and NP7 act as catalysts for this reaction because several turn overs are possible. In order to understand the reaction mechanism, the initial NO2– complexes of NP4 and NP7 were investigated by UV/vis absorption spectroscopy, resonance Raman (RR), EPR spectroscopy, and stopped-flow kinetics. These studies together with the crystallo-graphic investigations of wild-type NP4–NO2– revealed an 1-N binding mode, which is typical for most of the NO2– complexes of ferriheme models and proteins. In another at-tempt, a mutant protein was engineered by exchanging Leucine-130 in the distal heme pocket of NP4 with an Arginine residue. This mutant shows a much lower reactivity to-wards NO2– compared to wild-type NP4. The most significant difference is that the water network connecting Aspartate-30 with NO2– in the wild-type is disrupted in NP4(L130R). Aspartate-30 is estimated to have an unusually high pKa (5.6 - 7.4). It is, therefore, fea-sible to assume that Aspartate-30 may serve as a proton donor that is critical for the ni-trite disproportionation reaction. This is further supported by another mutant protein NP4(D30N) that shows also a decreased reactivity toward NO2–. Surprisingly, the X-ray crystal structure of NP4(L130R) determined at 100 K reveals an Arginine-130 coordination to the heme center where UV/vis, RR, and EPR spectra re-corded both at room temperature and in frozen solutions show a six-coordinate high spin (6cHS) heme complex with water as the sixth ligand. It was shown through dose-dependent X-ray irradiation on crystals observed by micro-absorbance spectroscopy that the ferric heme is readily reduced by a very low dose (0.45 MGy) of X-ray irradiation. It is, therefore, proposed that Arginine-130 coordinates to the ferrous heme at low tem-perature. This was further supported by the RR spectrum of the chemically reduced pro-tein at 77 K, which showed a six-coordinate low spin (6cLS) heme. Thus, NP4(L130R) represents the first example of an Arginine coordination to a metalloporphyrin. The ferrous oxidation state of NPs has been also studied. Although it is not the native oxidation state, it came recently into focus when the FeII-CO derivative was used as a isoelectronic model for the {FeNO}6 complex, for example in FT-IR and laser flash photolysis experiments. The first issue addressed was the effect of the routinely used reducing agent Na2S2O4 on the disulfides of NPs. An excess amount of Na2S2O4 is able to open the disulfides as has been identified by 13C NMR spectroscopy, reversed phase chromatography, and mass spectrometry. Ferrous NP4 and NP7 and their NO com-plexes were then characterized in detail by UV/vis and RR spectroscopy. Surprisingly, it was observed that only in the case of NP7 reduction leads to the breakage of the FeII–NHis bond. Further characterizations were carried out on the heme pocket mutant pro-teins NP4(D70A), NP2(V24E), NP7(E27V), and NP7(E27Q) as well as NP7 reconsti-tuted with symmetric heme. As a result, the spatial arrangement of the residues Gluta-mate-27, Phenylalanine-43, and Histidine-60 in the proximal heme pocket of NP7 is the reason for the weakened FeII–His60 bond through steric tension. In conclusion, the present study demonstrates NP4 and NP7 being the first examples of ferric hemes that promote the NO2– disproportionation reaction at neutral pH. This further expands the very diverse chemistry of heme models and proteins. Moreover, the very unique property of the heme pocket of NP7 was manifested in the breakage of the proximal Fe-His bond upon reduction of the iron to FeII. In case of the ferroheme protein soluble guanylate cyclase (sGC), which is the key sensor for NO in mammals, the FeII-His bond breaks upon NO binding and, thus, initiates signal transduction. Unfortunately, the structure of sGC is not available and the mechanism by which the FeII-His is cleaved is not fully understood. The present study shows that steric tension in combination with other factors, the most important of which certainly is the negative trans effect of NO, may play an important role in that event. | |||||||
| Lizenz: |  Urheberrechtsschutz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät | |||||||
| Dokument erstellt am: | 10.01.2012 | |||||||
| Dateien geändert am: | 10.01.2012 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 15.11.2011 | |||||||
| Datum der Promotion: | 13.12.2011 |
