Dokument: Molekulare Netzwerke: microRNAs in der neuronalen Differenzierung unrestringierter somatischer Stammzellen aus Nabelschnurblut (USSC)
| Titel: | Molekulare Netzwerke: microRNAs in der neuronalen Differenzierung unrestringierter somatischer Stammzellen aus Nabelschnurblut (USSC) | |||||||
| Weiterer Titel: | Molecular networks: microRNAs in the neuronal lineage differentiation of unrestricted somatic stem cells from cord blood (USSC) | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=20160 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20120112-114434-8 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Deutsch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Iwaniuk, Katharina Maria [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Prof. Dr. Müller, Hans Werner [Gutachter] Prof. Dr. Aberle, Hermann [Gutachter] | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie | |||||||
| Beschreibungen: | Im Verlaufe der vorliegenden Promotionsarbeit wurde der Einfluss von microRNAs auf die neuronale Differenzierung unrestringierter somatischer Stammzellen aus humanem Nabel-schnurblut (USSC) untersucht.
Die neuronale Differenzierung von USSC, mittels einer auf α-Retinsäure und weiteren Faktoren basierenden Induktion, wurde im Vorfeld beschrieben und diente als Basis für die vorliegende Arbeit. Es wurden von drei USSC-Linien und neuronal andifferenzierten Derivaten (XXL-USSC) umfassende microRNA-Expressionsprofile erstellt und analysiert. Dabei zeigte sich, dass im Zuge der 14 tägigen neuronalen Andifferenzierung von USSC eine Gruppe von 18 microRNAs gemeinsam herunterreguliert wurde. Diese microRNAs entstammen vorwiegend der miR 17 92-Familie, darüber hinaus wurden aber auch weitere microRNAs wie miR 137 und miR 138 herunterreguliert vorgefunden. Um die biologische Funktion dieser microRNAs im gegebenen zellulären System zu erfassen, wurden umfangreiche bioinformatische Zielgenvorhersagen durchgeführt und diese vorhergesagten Zielgene durch Analyse der „Gene-Ontology-Terms“ und Integrationen in “KEGG-Pathways“ neuronal relevanten biologischen Funktionen zugeordnet. Dabei zeigte sich, dass die Gruppe der zuvor genannten 18 microRNAs einen massiven potentiellen Einfluss auf eine Vielzahl von Komponenten relevanter Pathways wie „Axon Guidance“, „TGF-beta-„, „WNT“-, sowie „MAPK-Signaling“ und „Longterm Potentiation“ ausübt. So werden zum Beispiel mehr als 57% der Proteine des „Axon Guidance-Pathways“ von diesen microRNAs erfasst. Diese Beobachtungen implizieren, dass die genannten 18 microRNAs eine netzwerkartige Funktion im Rahmen der Neurodifferenzierung von USSC ausüben, wobei ihre Herunterregulation im Zuge der Differenzierung die Expression ganzer Gruppen neuronal relevanter Proteine „freigeben“ würde. Um die kreuzweise Vernetzung von microRNAs und potentiellen Zielgenen experimentell zu untermauern, wurde ein Assay etabliert, der auf der Klonierung der 3’UTR eines potentiellen Zielgens an das 3‘-Ende des Luciferase-ORF basiert. Von den 71 untersuchten individuellen vorhergesagten microRNA-Zielgeninteraktionen konnten 23 experimentell bestätigt werden. Dabei wurden für 9 von 10 microRNAs bis dato nicht bekannte Zielgene identifiziert. Unter Verwendung obiger Reporterkonstrukte konnte gezeigt werden, dass die Herunterregulation endogener microRNAs im Zuge der neuronalen Andifferenzierung von USSC zu einer verminderten Translationshemmung der mRNAs zuvor validierter Zielproteine führte. In Zusammenarbeit mit Sandra Weinhold (ITZ Uniklinikum Düsseldorf) und James Adjaye (MPI Berlin) erstellte Transkriptomanalysen mittels Illumina-Plattform von nativen und neuronal andifferenzierten USSC zeigten eine signifikante Anreicherung vorhergesagter Zielgene in der Gruppe von in XXL-USSC hochregulierten Proteinen. Der funktionale Einfluss der genannten microRNA-Gruppe auf die neuronale Differenzierung von USSC wurde durch simultane Überexpression von microRNA-Subgruppen während der XXL-Induktion untersucht. Es konnte ein deutlicher Einfluss auf die Morphologie sowie die Zellzahl festgestellt werden, eine quantitative real-time PCR-Analyse von 84 neuronal relevanten Genen (Neurogenesis and Neural Stem Cell Array) konnte diesen Einfluss auf mRNA-Ebene zum untersuchten Zeitpunkt jedoch nicht bestätigen.The major goal of this study was to analyze the impact of microRNAs on neuronal lineage differentiation of unrestricted somatic stem cells from human umbilical cord blood (USSC). This XXL-medium mediated differentiation method was published earlier. Differentiated cells (XXL-USSC) demonstrate a neuronal morphology, expression of neuronal markers and release of dopamine but no fast-activating and fast inactivating sodium currents could be detected. Three distinct USSC lines were differentiated into neuronal lineage for 14 days (XXL-USSC) and microRNA expression profiles were obtained using a qRT-PCR-based TaqMan assay. A set of 18 microRNAs was found consistently downregulated in all XXL-USSC lines and bioinformatical target gene predictions for this microRNA group revealed a large amount of putative target genes with functions in the context of neuronal differentiation, development and function. Strikingly, microRNAs and predicted target proteins were interwoven in a network-like manner, with many microRNAs sharing their target genes and vice versa. In addition, a large amount of predicted target proteins were identified as members of biochemical pathways important of neuronal differentiation and function („Axon Guidance“, „TGF-beta-„, „WNT“-, ”MAPK-Signaling“ and „Longterm Potentiation“). In example, more than 57% of axon guidance members were predicted to be targets of the 18 downregulated microRNAs. This observation implies a concerted regulatory network during USSC differentiation, but remained to be validated experimentally. Thus a luciferase reporter gene assay was established based on cloning of 3’UTRs from proteins of interest at the 3’-end of the firefly luciferase ORF. The cross-wise interaction between 10 selected microRNAs and 11 selected proteins could be demonstrated by positive experimental validation of 23 out of 71 individual microRNA/3’UTR-interactions tested. Furthermore, using these constructs, transfection experiments in USSC demonstrated that the translational repression of validated target proteins mediated by endogenous USSC microRNAs diminished in course of neuronal differentiation. Illumina transcriptome analyses (in cooperation with Sandra Weinhold, ITZ, Universitiy Clinic Düsseldorf and James Adjaye, MPI Berlin) revealed a statistically enriched amount of upregulated genes in XXL-USSC within the group of putative target genes for the 18 downregulated microRNAs. Using batches of microRNA mimics in transfections of USSC followed by induction of neuronal differentiation, overexpression of these microRNAs demonstrated an influence on neuronal differentiation at a morphological level and on the number of cells remaining after XXL-induction. Although genes important for neuronal differentiation and development (Neurogenesis and Neural Stem Cell Array) were found upregulated in day 5-7 XXL-USSC, overexpression of microRNAs using different microRNA mimic batches did not affect their expression pattern. These findings imply that despite the observed changes in morphology microRNAs do not (indirectly) affect transcription at this early time point in differentiation and these observed morphological effects are likely due to posttranslational regulatory effects. | |||||||
| Lizenz: |  Urheberrechtsschutz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät | |||||||
| Dokument erstellt am: | 12.01.2012 | |||||||
| Dateien geändert am: | 12.01.2012 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 23.09.2011 | |||||||
| Datum der Promotion: | 25.11.2011 |
