Dokument: Charakterisierung des Msb2 Sensorproteins in Candida albicans

Titel:	Charakterisierung des Msb2 Sensorproteins in Candida albicans
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=20110
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20111220-114212-5
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Szafranski-Schneider, Eva Maria [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 4,18 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 17.12.2011 / geändert 17.12.2011
Beitragende:	Prof. Dr. Ernst, Joachim F. [Gutachter] Prof. Dr. Klein, Thomas [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Die Virulenz des humanpathogenen Pilzes C. albicans hängt von der Fähigkeit ab, seine Zellstruktur an Umgebungsbedingungen anzupassen. Das TypI-Membranprotein Msb2 in der Cytoplasmamembran von C. albicans ist für die Hyphenbildung und den Erhalt der Zellwand verantwortlich. Im Rahmen dieser Arbeit wurde Msb2 biochemisch und funktionell charakterisiert, wobei insbesondere seine posttranslationale Modifikationen und das Sekretionsverhalten untersucht wurden. C. albicans-Stämme wurden konstruiert, die für eine Msb2-Variante kodieren, in der die große N-terminale extrazelluläre Domäne mit einem HA-Epitop und die kleine C-terminale cytoplasmatische Domäne mit einem V5-Epitop markiert sind. Analysen des produzierten Msb2 ergaben, dass die extrazelluläre Domäne quantitativ abgespalten und ins Medium sekretiert wird, während die cytoplasmatische Domäne in der Zelle verbleibt. Yapsin-ähnliche Proteasen Sap9 und Sap10 sind an der Msb2-Spaltung nicht beteiligt. Mittels Gelfiltrationschromatographie wurde die molekulare Masse der sekretierten Msb2-Domäne mit 470 - 610 kDa ermittelt (theoretischer Wert 132 kDa). Der hohe Serin- und Threonin-Gehalt (43 %) in der extrazellulären Domäne wies auf eine hohe O-Glykosylierung hin, die durch chemische Behandlung mit Trifluoromethansulfonsäure entfernt und somit bestätigt wurde. Durch Untersuchungen verschiedener C. albicans-Mutanten konnte festgestellt werden, dass die Proteinmannosyltransferase Pmt1 für die O-Glykosylierung von Msb2 teilweise verantwortlich ist. Obwohl Msb2 5 potentielle N-Glykosylierungsstellen beinhaltet, scheint das Protein nicht oder nur in geringem Maße N-glykosyliert zu sein. Struktur-Funktionsuntersuchungen ergaben, dass die cytoplasmatische Msb2-Domäne für die Funktion von Msb2 entbehrlich ist. Zusätzliche Deletion der Transmembranregion führte dagegen zum vollständigen Funktionsverlust. Überraschenderweise war eine Msb2-Variante mit einer N-terminalen Deletion von 450 AS innerhalb der extrazellulären Region voll funktionstüchtig. Da diese Msb2-Variante, die stromabwärts von Msb2 agierende MAP Kinase Cek1 möglicherweise konstitutiv aktiviert, könnte der deletierte Bereich vermutlich eine Regulationsfunktion haben und eine aktivierende Msb2-Region in Abhängigkeit von seinem Glykosylierungsstatus verdecken und regulieren. Im Rahmen einer normalen Immunantwort des Menschen auf eine mikrobielle Infektion werden verschiedene antimikrobielle Peptide produziert, die Pathogene wie C. albicans abtöten können. Überraschend zeigte sich, dass die sekretierte extrazelluläre Msb2-Domäne als Schutzprotein gegen das antimikrobielle Peptid Histatin 5 fungiert. In Gegenwart des Histatin 5 stieg die Lebensfähigkeit der Zellen stark an, wenn die gereinigte extrazelluläre Msb2-Domäne zugegeben wurde. Das Msb2-Protein übernimmt somit mehrere voneinander unabhängige Funktionen, da es zum einen die Zellwand-Integrität und die Filamentbildung steuert und zum anderen als Schutzprotein gegen antimikrobielle Peptide dient. Virulence of the human fungal pathogenic C. albicans depends on the ability to adapt its cell structure to environmental conditions. The type I membrane protein Msb2 in the cytoplasmic membrane of C. albicans is responsible for hypha formation and integrity of the cell wall. Within the scope of this dissertation Msb2 was characterized biochemically and functionally focusing on its posttranslational modifications and secretion. C. albicans strains were constructed that code for a Msb2 variant, in which the large N-terminal extracellular domain is tagged with an HA-epitope and the small C-terminal cytoplasmatic domain is tagged with a V5-epitope. Analysis of the produced Msb2 protein showed that the extracellular domain was quantitatively cleaved and secreted into the media, while the cytoplasmatic domain remained in the cell. Yapsin-like proteases Sap9 and Sap10 were not involved in Msb2 cleavage. By gel filtration chromatography the molecular mass of the secreted Msb2 domain was determined as 470 - 610 kDa (theoretical value 132 kDa). High serine and threonine content (43%) of the extracellular domain suggested a high level of O-glycosylation, which was removed by chemical treatment with trifluoromethanesulfonic acid and thereby confirmed. Analyses of different C. albicans mutants revealed that the proteinmannosyltransferase Pmt1 is partially responsible for the O-glycosylation of Msb2. Although Msb2 contains 5 potential N-glycosylation sites the protein is not or not significantly N-glycosylated. Structure-function studies showed that the cytoplasmatic Msb2 domain is not essential for the function of Msb2. In contrast, additional deletion of the transmembrane region led to a complete loss of function. Surprisingly, a Msb2 variant protein with a N-terminal deletion of 450 amino acids within the extracellular region was fully functional. Because this Msb2 variant is probably able to activate the MAP Kinase Cek1, which operates downstream of Msb2, the deleted region could have a regulatory function to regulate an activating Msb2 region depending on its state of glycosylation. Within the scope of a normal human immune response to a microbial infection several antimicrobial peptides are produced, which kill pathogens including C. albicans. Unexpectedly, the secreted extracellular Msb2 domain acted as a protective protein against the antimicrobial peptide histatin 5. In the presence of the histatin 5 the viability of the cells increased strongly, if the purified extracellular Msb2 domain was added. Therefore, the Msb2 protein assumes several independent functions, because on the one hand it controls cell wall integrity and hypha formation and on the other hand it serves as a protective protein against antimicrobial peptides.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie
Dokument erstellt am:	20.12.2011
Dateien geändert am:	20.12.2011
Promotionsantrag am:	05.09.2011
Datum der Promotion:	19.10.2011