Dokument: mRNA-Abbau in Chloroplasten höherer Pflanzen:
Mechanismus und Kontrolle

Titel:	mRNA-Abbau in Chloroplasten höherer Pflanzen: Mechanismus und Kontrolle
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=2011
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20000710-000011-2
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Horlitz, Martin [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 14,27 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 09.02.2007 / geändert 09.02.2007
Beitragende:	Prof. Dr. Riesner, Detlev [Gutachter] Prof. Dr. Westhoff, Peter [Gutachter] PD Dr. Klaff, Petra [Gutachter]
Stichwörter:	Chloroplasten, mRNA, Stabilität, posttranskriptionelle Kontrolle, mRNA-Abbaumechanismus, Magnesium, konservierte RNA-Struktur, Tabak, Spinat, Arabidopsischloroplasts, mRNA, stability, posttranscriptional control, degradation mechanism, magnesium, conserved RNA structure, tobacco, spinach, Arabidopsis
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	In Chloroplasten höherer Pflanzen wird die Akkumulation von mRNAs während der Blattentwicklung durch genspezifische mRNA-Stabilisierung erreicht. Die vorliegende Arbeit hatte die Untersuchung der Mechanismen zum Inhalt, nach denen der Abbau von mRNA-Molekülen in Chloroplasten abläuft, sowie die Art und Weise, wie der mRNA-Abbau genspezifisch reguliert wird. Zu diesem Zweck wurde zunächst ein Überblick über den mRNA-Metabolismus in Chloroplasten anhand der Bestimmung von in vivo-Halbwertszeiten plastidärer mRNAs gewonnen. Die Bedeutung von mRNA-Sekundärstrukturen wurde durch die Rechner-gestützte Vorhersage konservierter Strukturelemente untersucht. Zur näheren Charakterisierung von Mechanismus und Kontrolle des mRNA-Abbaus wurde ein in vitro-RNA-Degradationssystem eingesetzt, daß die Identifizierung cis-regulatorischer Elemente und trans-regulatorischer Faktoren erlaubte. In Tabak (Nicotiana tabacum) und Arabidopsis thaliana wurden die Halbwertszeiten t1/2 der mRNAs der Gene bzw. Operons psbA, rbcL, psaA/B-rps14 und atpB/E bestimmt. Diese liegen im Bereich von 5 bis über 50 Stunden und entsprechen den Werten, die bereits für mRNA-Stabilitäten in Chloroplasten von Spinat und Gerste bekannt waren, so daß darauf geschlossen werden kann, daß die grundlegenden Charakteristika des mRNA-Metabolismus bei allen Angiospermen gleich sind. Die theoretische Vorhersage konservierter Sekundärstrukturen innerhalb der psbA- und rbcL-mRNAs der Angiospermen mit Hilfe des Programms ConStruct ergab, daß beide mRNAs eine Reihe konservierter Haarnadelstrukturen enthalten, wobei sich eine hochkonservierte Struktur in der 3´-untranslatierten Region, und eine weniger stark konservierte Struktur in der 5´-untranslatierten Region befindet. Die psbA-mRNA besitzt generell deutlich mehr konservierte Struktur als die rbcL-mRNA. Der Mechanismus des spezifischen Abbaus der psbA-mRNA wurde in lysierten Chloroplasten sowie in organello untersucht: Hochauflösende Northern-Analysen ergaben, daß der Abbau der psbA-mRNA durch spezifische endonukleolytische Schnitte in der 5´-untranslatierten Region eingeleitet wird, als deren Folge der verbleibende distale Rest der mRNA empfindlich für weitere Schnitte innerhalb der kodierenden Region wird. Ferner konnte in vitro demonstriert werden, daß doppelsträngige RNA kein Substrat für plastidäre Nukleasen darstellt. In dieser Arbeit konnte erstmals gezeigt werden, daß Magnesiumionen in vitro genspezifisch die Halbwertszeiten plastidärer RNAs beeinflussen: In lysierten Chloroplasten benötigt die tRNA-His mindestens ca. 3 µM, die 16S-rRNA mindestens ca. 2 mM und die rbcL-mRNA mindestens ca. 3 mM Mg2+, um physikalisch stabil zu werden. Die psbA-mRNA, deren Stabilität als einzige der betrachtene RNAs sich während der Blattentwicklung deutlich erhöht, wird bei einer Mg2+-Konzentration von ca. 6 mM in hochkooperativer Weise stabilisiert. Da die Konzentration an freien Mg2+-Ionen im Stromakompartiment von Chloroplasten während der Organellentwicklung von 3 - 4 mM auf 8 - 10 mM ansteigt, muß Mg2+ als ein Kandidat für einen genspezifisch wirkenden RNA-Stabilisierungsfaktor angesehen werden. Die Analyse von Degradationsfragmenten der psbA-mRNA in Abhängigkeit von der Mg2+-Konzentration in vitro konnten Hinweise darauf liefern, daß Magnesium die mRNA durch Blockieren definierter endonukleolytischer Schnittstellen im 5´-Bereich der mRNA stabilisiert. In higher plant chloroplasts, the accumulation of mRNAs during leaf development is mediated by gene-specific mRNA stabilization. The main topic of this dissertation is the investigation of degradation mechanisms of mRNA molecules in chloroplasts and the elucidation of the gene-specific regulation of mRNA decay. First of all, a general overview on mRNA metabolism in chloroplasts was achieved by measuring in vivo half-lives of plastid mRNAs. For further characterization of mechanism and control of mRNA degradation, an in vitro RNA degradation system was used which allowed for identification of cis-regulatory elements and trans-regulatory factors. The relevance of mRNA secondary structures was analyzed by computer-assisted prediction of conserved secondary structure elements. In tobacco (Nicotiana tabacum) and Arabidopsis thaliana the half-lives of mRNAs of the genes/operons psbA, rbcL, psaA/B-rps14 and atpB/E were determined. psbA mRNA is the most stable mRNA (t1/2 > 50 h) in both plant species, followed by rbcL (t2/2 about 15 - 20 h). psaA/B-rps14 and atpB/E mRNAs are less stable, with t1/2 about 5 - 8 h. These half-lives correspond to values obtained for mRNA stabilites in Spinach and barley chloroplasts. Therefore, the basic characteristics of mRNA metabolism are conserved among all angiosperms. The mechanism of psbA mRNA degradation was analyzed in an in vitro degradation system (lysed spinach chloroplasts) and in organello High resolution northern analysis revealed that the specific degradation of psbA mRNA is initiated by site-specific endonucleolytic cleavages within the 5´ untranslated region, rendering the remaining distal part of the molecule susceptible for further endonucleolytic cleavages within the coding region. Cleavages can occur only at single stranded sites pointing to a scenario according to which degradation initiation is dependent on a proper RNA conformation. Magnesium ions could be identified as a trans-acting factor for differential mRNA stability in higher plant chloroplasts. In lysed chloroplasts, tRNA_{His} needs at least 3 µM, 16S rRNA needs 2 mM, and rbcL mRNA 3 mM Mg2+(free) to gain physical stability. The psbA mRNA shows an exceptional strongly cooperative (Hill coefficient about 7) Mg2+-dependent stabilization at 6 mM Mg2+(free). This is the only RNA - among the RNA species analyzed - which is stabilized in vivo during chloroplast maturation. Determination of levels of free Mg2+ ions in the stroma compartment of chloroplasts revealed an increase of Mg2+(free) from 3 - 4 mM in young to 8 - 10 mM in mature chloroplasts. This demonstrates that Mg2+ plays a role as a gene-specifically acting factor for mRNA stability - most likely due to a direct interaction with the mRNA molecule. The analysis of patterns of psbA mRNA degradation fragments showed a site-specific Mg2+ dependent protection of cleavage sites within the 5´ untranslated region which can account for the specific Mg2+-mediated stabilization of psbA mRNA. These observations lead to the proposal that magnesium regulates the accessibility of the psbA mRNA 5´ untranslated region by direct binding to the RNA and hence by alterations of the RNA conformation. This is further supported by predictions of conserved secondary structures which yield a converved but flexible secondary structure within the mRNA 5´ untranslated region.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie
Dokument erstellt am:	10.07.2000
Dateien geändert am:	12.02.2007
Promotionsantrag am:	10.07.2000
Datum der Promotion:	10.07.2000