Dokument: Charakterisierung der Nisin Dehydratase NisB

Titel:	Charakterisierung der Nisin Dehydratase NisB
Weiterer Titel:	Characterization of the nisin dehydratase NisB
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=19968
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20111201-130353-3
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Mavaro, Antonino [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 9,84 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 29.11.2011 / geändert 29.11.2011
Beitragende:	Prof. Dr. Schmitt, Lutz [Gutachter] PD Dr. Schulte, Ulrich [Gutachter]
Stichwörter:	Dehydratase NisB, Nisin, SPR, Biacore, HPLC, Protein-Peptid Interaction, Protein purification
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 540 Chemie
Beschreibungen:	Zusammenfassung Nisin ist ein antibakteriell wirksames Peptid, welches vom Milchsäurebakterium Lactococcus lactis ribosomal als ein 57 Aminosäuren langes Prepeptid synthetisiert wird. Posttranslationale Modifikationen führen zu den unnatürlichen Aminosäuren Dehydrobutyrin und Dehydroalanin als auch zu den Thioetheraminosäuren Lanthionin und Methyllanthionin, die intramolekulare Ringstrukturen ausbilden. Da Nisin ein Lanthionin-haltiges Peptidantibiotikum ist zählt es zu der Gruppe der Lantibiotika. Für die posttranslationale Modifikationen sind die Enzyme NisB und NisC verantwortlich. Die Dehydratase NisB katalysiert die spezifische Dehydrierung von Serin und Threonin und die Cyclase NisC katalysiert die Bildung der (Methyl)lanthioninringe. Das komplett modifizierte Prenisin wird von dem Transporter NisT exportiert und das 23 Aminosäuren lange Leader Peptide wird von der Protease NisP abgeschnitten. Diese Dissertation untersuchte die Interaktion der Dehydratase NisB mit unmodifizierten, dehydrierten und komplett modifizierten Prenisin in vitro. Um homogenes Enzym und homogene Peptide zu erhalten, wurden die Reinigungen des Enzyms und der Peptide optimiert. Das gereinigte Enzym und die Peptide wurden mittels statischer Lichtstreuung und HPLC analysiert. Die statische Lichtstreuung zeigte das NisB in Lösung einen stabilen Dimer bildet. Unmodifiziertes, dehydriertes und komplett modifiziertes Prenisin wurden durch HPLC Analysen identifiziert. Mittels Größenausschluss-Chromatographie und Oberflächen-Plasmon-Resonanz Messungen wurde die Interaktion zwischen NisB und den verschiedenen Prenisin analysiert. Unmodifiziertes Prenisin bindet mit einer Dissoziationskonstante von 1.05 ± 0.25 μM an NisB, wohingegen dehydriertes und komplett modifiziertes Prenisin mit Dissoziationskonstanten von jeweils 0.31 ± 0.07 μM und 10.5 ± 1.7 μM an NisB binden. Dabei wies komplett modifiziertes Prenisin eine mehr als 20fach höhere Dissoziationsrate auf. Alle drei Prenisine binden an dimerisiertes NisB mit einer 1:1 Stöchiometrie. Nisin, welches kein Leader Peptid aufweist und ein weiteres Prenisin, bei welchem die im Leader Peptid konservierte FNLD-Box zu AAAA mutiert wurde, konnten ebenfalls nicht an NisB binden. Das intakte Leader Peptid ist somit essentiell für die initiale Erkennung und Bindung der Prenisine an NisB. Dabei ist NisB in der Lage zwischen unmodifizierten, dehydrierten und komplett modifizierten Prenisin zu unterscheiden. Abstract Nisin, consists of 34 amino acids, is antimicrobial active against Gram-positive bacteria and comprises five (methyl)lanthionine rings. Thus, nisin belongs to the group of lantibiotics. Nisin is ribosomally produced by Lactococcus lactis as a 57 amino acids long prepeptide. Posttranslational modifications introduce the dehydrated amino acids dehydrobutyrine and dehydroalanine as well as the cyclic thioether amino acids lanthionine and methyllanthionine. The enzymes involved in the posttranslational modification are NisB, which dehydrates specific serine and threonine residues in prenisin, and the cyclase NisC, which catalyzes (methyl)lanthionine formation. Fully modified prenisin is exported by the ATP-binding cassette (ABC) transporter NisT and the 23 amino acids long leader peptide is cleaved off by the extracellular protease NisP. Although much is known about its antimicrobial activity and mode of action, well-founded knowledge about the modification process is still rather limited. In this work the in vitro interaction of the dehydratase NisB with unmodified, dehydrated and fully modified prenisin was investigated. Therefore, purifications of the enzyme and the different peptides were optimized to gain homogenous enzyme and prepeptides. Furthermore, the enzyme and the prepeptides were characterized by light scattering and HPLC analysis. Light scattering analysis demonstrated that purified NisB is a dimer in solution and HPLC analysis was used to identify unmodified, dehydrated and fully modified prenisin. Using size exclusion chromatography and surface plasmon resonance, the interaction of NisB and unmodified, dehydrated and fully modified prenisin was studied. Unmodified prenisin binds to NisB with a dissociation constant of 1.05 ± 0.25 μM, whereas the dehydrated and the fully modified derivatives bind with respective dissociation constants of 0.31 ± 0.07 μM and 10.5 ± 1.7 μM. The much lower affinity for the fully modified prenisin related to a >20-fold higher off rate. For all three peptides the stoichiometry of binding was 1:1. Active nisin, which is the equivalent of fully modified prenisin lacking the leader peptide did not bind to NisB, nor did prenisin in which the highly conserved FNLD-box within the leader peptide was mutated to AAAA. Taken together the data indicate that the leader peptide is essential for initial recognition and binding of prenisin to NisB, and that NisB can discriminate between unmodified, dehydrated and fully modified prenisin.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Chemie » Biochemie
Dokument erstellt am:	01.12.2011
Dateien geändert am:	01.12.2011
Promotionsantrag am:	17.08.2011
Datum der Promotion:	21.11.2011