Dokument: Mechanistische Analysen immuntoxischer Substanzeffekte auf die humorale Reaktion in Mishell-Dutton-Kulturen

Titel:	Mechanistische Analysen immuntoxischer Substanzeffekte auf die humorale Reaktion in Mishell-Dutton-Kulturen
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=19872
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20111116-082947-4
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Köper, Lydia Mareen [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 2,34 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 14.11.2011 / geändert 14.11.2011
Beitragende:	PD Dr. Vohr, Hans-Werner [Gutachter] Prof. Dr. Wagner, Rolf [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Verschiedene Richtlinien zur toxikologischen Risikobewertung von Medikamenten, Pflanzenschutzmitteln und Chemikalien sehen die Durchführung eines immunologischen Funktionstests zur Erfassung immuntoxischer Substanzeffekte vor. Aufgrund aktueller ethischer und politischer Entwicklungen, die eine Einschränkung und möglichst einen vollständigen Ersatz des Einsatzes von Tieren zu Versuchszwecken fordern, wird verstärkt an der Entwicklung von Ersatzmethoden gearbeitet. In der hier vorliegenden Arbeit wurden zwei Methoden zur Detektion immunsuppressiver Substanzeffekte auf ihre korrekte Vorhersagewahrscheinlichkeit in vitro analysiert. Dabei handelte es sich zum einen um Mitogenstimulationsversuche und zum anderen um Mishell-Dutton-Kulturen. Die Ergebnisse der Mitogenstimulationsversuche zeigen, dass ein Einsatz dieser Methode zur Bestimmung immunsuppressiver Substanzeffekte in vitro generell fragwürdig ist. Selbst beim Einsatz gut erforschter Standardsubstanzen traten mit dieser Methode viele Probleme auf, die eine sichere Einstufung der gemessenen Substanzeffekte in die Kategorien immunsuppressiv und nicht-immunsuppressiv zum Teil verhinderten. Es wird daher mit dieser Methode in Zukunft nicht möglich sein, bisher unerforschte Substanzen korrekt zu klassifizieren und einen Tierversuch zu ersetzen. Die Mishell-Dutton-Kultur wurde zunächst an murinen Milzzellen im Labor etabliert und optimiert. Anschließend wurde versucht, die Methode auf Milzzellen der Ratte und periphere mononukleäre Zellen (PBMC) der Maus, der Ratte und des Menschen zu übertragen. Es konnte allerdings mit diesen Zellen keine ausreichend starke humorale Immunreaktion ausgelöst werden, wie sie für eine Analyse immuntoxischer Substanzeffekte notwendig wäre. Die Ursachen dafür wurden an Rattenmilzzellen in Form von Analysen der CD4-positiven T-Zellfraktion näher untersucht. Der Anteil regulatorischer T-Zellen (Treg) war im zeitlichen Verlauf der Kultur im Vergleich zu murinen Milzzellen hochreguliert und supprimierte so möglicherweise die humorale Immunreaktion. Die Mishell-Dutton-Kultur mit murinen Milzzellen wurde zur Analyse immunsuppressiver Substanzeffekte in vitro eingesetzt. Im Gegensatz zur Mitogenstimulation konnten mit dieser Methode, insbesondere nach dem Einfügen eines metabolisch aktiven Systems, acht immunsuppressive und vier nicht-immunsuppressive Substanzen korrekt und reproduzierbar klassifiziert werden. Wenn sich die hohe Spezifität und Sensitivität auch für weitere Substanzen bestätigt, wäre der Mishell-Dutton-Test bestens geeignet, einen in vivo/ex vivo durchgeführten immunologischen Funktionstest zu ersetzen. Des Weiteren wurde die Mishell-Dutton-Kultur mit murinen Milzzellen zur Analyse des Immunsuppressions-Mechanismus der Substanz Urethan in vitro eingesetzt, die vergleichend zur in vivo Situation erfolgte. Die Versuchsergebnisse belegen eine Metabolisierung des Urethans, die in vitro durch zelleigene P450-Cytochrome katalysiert wird. Dabei ist es als sehr wahrscheinlich anzusehen, dass CYP2E1 diese Aufgabe übernimmt. Anhand der aus der Mishell-Dutton-Kultur gewonnenen Daten lässt sich vermuten, dass hauptsächlich N-Hydroxyurethan die immunsuppressive Wirkung ausübt. Für einen eindeutigen Nachweis wären jedoch weitere Analysen notwendig. Different guidelines for the toxicological risk assessment of drugs, pesticides and chemicals ask for functional immune assays for the detection of immuntoxic properties of compounds. For ethical and political reasons the use of animal testing should be reduced and whenever possible completely replaced. Because of this an increasing activity in the field of the development of alternatives to animal testing is observed. For the work presented here two different methods were investigated for their correct prediction of immunotoxic properties of compounds in vitro. One was the use of mitogen stimulation assays and the other the use of Mishell-Dutton cultures. The results obtained with mitogen stimulations show that the variability was extreme and the use for this purpose therefore rather problematic. Even well established standard compounds could not always be categorized reliably and clearly. Due to this the method will not be suitable to correctly predict immuntoxic properties of unknown compounds and to replace animal testing. The Mishell-Dutton culture was established and optimized using murine spleen cells. Next efforts were made to adapt the protocol to spleen cells from the rat and to peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from mice, rats and humans. It was not possible to induce a humoral immune response that would be strong enough for the analyses of immunotoxic properties of compounds. The reason for this was investigated by subpopulation analysis of CD4-positive T cells. The amount of regulatory T cells (Treg) was upregulated in rat spleen cells in comparison to murine spleen cells over the time course of the Mishell-Dutton culture. It can be assumed that these Tregs suppressed the humoral immune response in rats. The Mishell-Dutton culture with murine spleen cells was used for analyses of immunotoxic properties of compounds in vitro. In contrast to mitogen stimulation assays this method was suitable for a correct and reproducible categorization of eight immunsuppressants and four nonimmunosuppressants, especially after integrating a metabolic system into the assay system. If the high sensitivity and specifity can be confirmed with additional compounds the method will be suitable for a replacement of an in vivo/ex vivo functional immune test. Additionally, Mishell-Dutton cultures were used for the analysis of the mechanism of the compound Urethane to induce mmunosuppression. The data obtained in vitro was compared to the in vivo situation. The results show a metabolization of urethane, which is catalyzed by P450 cytochromes of the splenic cells themselves. It is likely that CYP2E1 is the appropriate enzyme. According to the data obtained from different experiments it can be speculated that N-Hydroxyurethane is the metabolite generating immunotoxic effects. For verification further analyses are necessary.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie
Dokument erstellt am:	16.11.2011
Dateien geändert am:	16.11.2011
Promotionsantrag am:	18.07.2011
Datum der Promotion:	14.11.2011