Dokument: Identifizierung und Charakterisierung neuer Funktions- und Regulationsmechanismen des CDK-Inhibitors p21WAF1/CIP1

Titel:	Identifizierung und Charakterisierung neuer Funktions- und Regulationsmechanismen des CDK-Inhibitors p21WAF1/CIP1
Weiterer Titel:	Identification and characterisation of new functional and regulatory mechanisms of the CDK inhibitor p21WAF1/CIP1
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=19737
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20111027-091026-4
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Neise, Denise [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 14,14 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 26.10.2011 / geändert 26.10.2011
Beitragende:	Prof. Dr. Jänicke, Reiner [Gutachter] Prof. Dr. Wagner, Rolf [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Der Transkriptionsfaktor p53 spielt als Tumorsuppressor-Protein eine zentrale Rolle bei der zellulären Antwort auf genotoxischen Stress. Bis heute ist jedoch ungeklärt, wie p53 bei verschiedenen Stimuli über das Zellschicksal entscheidet. Da seine Aktivität und Promotor-Spezifität im Wesentlichen durch post-translationale Modifikationen reguliert wird, wurden in der vorliegenden Arbeit die Acetylierungs- und Phosphorylierungsmuster von p53 in apoptotischen und seneszenten HCT116 Kolon-Karzinom-Zellen verglichen. Hierbei trat ein deutlicher Zusammenhang zwischen dem Phosphorylierungszustand von p53 und der An bzw. Abwesenheit des CDK-Inhibitors p21WAF1/CIP1 hervor, was auf eine entscheidende Funktion von p21 in p53-phosphorylierenden Prozessen hindeutete. Tatsächlich bestätigten in vitro Kinase-Reaktionen, dass p21 die Aktivität verschiedener p53-phosphorylierender Kinasen wie der MAP Kinasen JNK1/2, p38α und ERK1/2 sowie GSK-3β unterschiedlich modulierte. Insbesondere aber konnte in dieser Dissertation erstmals gezeigt werden, dass p21 hierbei in einer bemerkenswerten Substrat-Abhängigkeit nicht nur einen inhibierenden, sondern auch einen aktivierenden Einfluss auf diese Kinasen ausübte. Untersuchungen zur Beteiligung der MAPKs an der zellulären Antwort auf genotoxischen Stress zeigten, dass die pharmakologische Inhibition der ERK-aktivierenden MEKs, jedoch nicht die Inhibition der JNKs oder der p38 MAPK, HCT116-Zellen effektiv vor strahlungsinduzierter Apoptose schützte. Dieser Effekt war allerdings unabhängig von p21. Demgegenüber vermochte die pharmakologische Inhibition der RSKs, welche von ERK1/2 aktiviert werden, nur p53-defiziente HCT116-Zellen vor strahlungsinduzierter Apoptose zu schützen, nicht aber p21-defiziente Zellen. Auch führte sie, ebenfalls in Abhängigkeit von p21, nicht nur bestrahlte Zellen in die zelluläre Seneszenz, sondern auch unbestrahlte, was eine enge funktionelle Verknüpfung zwischen RSKs und p21 vermuten ließ. Interessanterweise verursachte die pharmakologische wie auch die spezifische RSK Inhibition mittels BI-D1870 bzw. durch siRNA eine rasche Akkumulation des p21 Proteins, die weder p53-vermittelt noch transkriptionell reguliert war. Basierend auf diesen Beobachtungen sowie auf massenspektrometrischen Untersuchungen und Mutationsanalysen demonstriert die vorliegende Dissertation zum ersten Mal, dass die RSK Isoformen 1, 2 und 3 das p21-Protein in vitro an Ser116, einer neuen und bisher unbekannten Phosphorylierungsstelle innerhalb des p21-Proteins, sowie an Ser146 im Konsensusmotiv für AGC-Kinasen phosphorylieren. Weitere Untersuchungen zur physiologischen Bedeutung dieser RSK-p21-Interaktion zeigten, dass eine schnelle Degradation des p21 Wildtyp-Proteins in einer RSK- und Proteasom-abhängigen Weise induzierbar war, wohingegen die Expression einer RSK-unphosphorylierbaren p21 Doppelmutante (S116/146A) in der Anwesenheit aktiver RSKs unbeeinflusst blieb. Damit beschreibt diese Dissertation einen neuen und wichtigen Regulationsmechanismus für p21, indem sie eine direkte Verbindung zwischen RSKs und p21 aufzeigt und dadurch die von diesen Kinasen kontrollierten Signalwege erweitert. As a tumorsuppressor protein, the transcription factor p53 plays a central role in cellular responses to genotoxic stress. However, it is still very much unclear how p53 decides the fate of a cell upon exposure to different stimuli. As its activity and promoter specifity is essentially regulated by post-translational modifications, the acetylation and phosphorylation patterns of p53 in apoptotic and senescent HCT116 colon carcinoma cells were compared in the present work. Thereby it was found that the absence or presence of the CDK inhibitor p21 greatly influenced the phosphorylation pattern of p53 indicating that p21 plays a pivotal role in this process. Indeed, in vitro kinase assays revealed that p21 differentially modulates various p53-phosphorylating kinases such as MAP kinases JNK1/2, p38α and ERK1/2 as well as GSK-3β. Even more important was the finding that p21 not only inhibits these kinases, but is also able to activate them in a remarkable substrate-dependent manner, a finding that was not described before. Investigations concerning the participation of MAPKs in cellular responses to genotoxic stress demonstrated that pharmacological inhibition of the ERK-activating MEKs, but not inhibition of JNKs or p38 MAPK, effectively protected HCT116 cells from irradiation-induced apoptosis. However, this event was mediated in a p21-independent manner. In contrast, pharmacological inhibition of RSKs, that are downstream effectors of ERK1/2, protected only p53-deficient HCT116 cells from irradiation-induced apoptosis, but not p21-deficient cells. In addition, depending on the presence of p21, RSK inhibition drived not only irradiated cells into cellular senescence, but also unstressed cells, suggesting a close functional relationship between RSKs and p21. Interestingly, pharmacological and specific inhibition of RSKs by BI D1870 and siRNAs, respectively, caused a rapid accumulation of p21 that was not mediated by p53 and that was independent of transcriptional events. Based on these findings as well as on masspectrometric analyses and mutagenesis studies, this PhD thesis demonstrates for the first time that the RSK isoforms 1, 2 and 3 phosphorylate p21 at Ser116, which is a novel and unknown phosphorylation site within the p21 protein, and Ser146, lying within the consensus site for AGC kinases. Further investigations concerning the physiological relevance of this RSK-p21 interaction revealed that rapid degradation of the p21 wild-type protein is inducible in a RSK- and proteasome-dependent manner, whereas expression of a RSK-unphosphorylatable p21 double mutant (S116/146A) remained unaffected in the presence of active RSKs. Thus, this PhD thesis uncovers a novel and important mechanism of p21 regulation providing a direct link between RSKs and p21 that further extends the pathways controlled by these kinases.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie
Dokument erstellt am:	27.10.2011
Dateien geändert am:	27.10.2011
Promotionsantrag am:	25.08.2011
Datum der Promotion:	18.10.2011