Dokument: Der Einfluss der extrazellulären Matrix auf den Phänotyp, die Gen- und Proteinexpression und die EGFR Inhibition bei kolorektalen Tumorzelllinien
| Titel: | Der Einfluss der extrazellulären Matrix auf den Phänotyp, die Gen- und Proteinexpression und die EGFR Inhibition bei kolorektalen Tumorzelllinien | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=18987 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20110825-072436-2 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Deutsch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Dr. rer. nat. Luca, Anna Clarissa [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Prof. Dr. Stoecklein, Nikolas Hendrik [Gutachter] Prof. Dr. Martin, William [Gutachter] | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie | |||||||
| Beschreibungen: | Die Kultivierung permanenter Tumorzelllinien ist die wichtigste Möglichkeit unter kontrollierten Bedingungen funktionelle Studien an humanen Tumorzellen in vitro durchzuführen. Die am häufigsten angewandte Methode hierbei ist die Kultivierung der Tumorzellen als zweidimensionaler (2D) Monolayer auf Plastiksubstraten, bei der die Tumorzellen jedoch völlig getrennt von ihrer natürlichen in vivo Umgebung betrachtet werden. Daher wurden Kultursysteme entwickelt, die eine realistischere Modellierung von Tumoren in vitro erlauben. In diesem Zusammenhang ist die Kultivierung in extrazellulärer Matrix (ECM) ein sehr interessantes Modell. Die ECM ist ein essentieller Bestandteil der natürlichen Umgebung von Tumorzellen in vivo und liefert den Tumorzellen essentielle Signale für Zellpolarität, Wachstum und Zellüberleben.
Ziel der vorliegenden Arbeit war es, für repräsentative, permanente Tumorzelllinien des kolorektalen Karzinoms (CRC) ein ECM Kultivierungsmodell zu etablieren und die zellbiologischen, sowie molekularen Auswirkungen der unterschiedlichen Kultursysteme systematisch zu untersuchen. Für die ECM Kultur wurden die CRC Zelllinien in lamininreiche extrazelluläre Matrix (lrECM) eingebettet („on-top“ Assay), wobei jede der untersuchten Zelllinien eine eigene und reproduzierbare Tumor-ähnliche Morphologie ausbildete. Diese ließ jedoch keine Rückschlüsse auf das morphologische Bild der 2D Kultur zu. Es zeigten sich grundsätzlich zwei verschiedene Morphologietypen: locker aufgebaute Sphäroide, sowie kompakt wachsenden Sphäroide. Interessanterweise entwickelten sich alle locker aufgebauten Sphäroide aus Zelllinien, die aus Metastasen isoliert wurden, während alle kompakten Sphäroide von Zelllinien gebildet wurden, die von Primärtumoren abstammten. Jedoch zeigten sich in Bezug auf diese Morphologietypen keine Unterschiede in der Migrations- oder Invasionsfähigkeit der Zelllinien. Die Zellproliferation der locker aufgebauten Sphäroide war, gegenüber den kompakt wachsenden Sphäroiden, in der lrECM „on-top“ Kultur signifikant reduziert. Die beobachteten, erheblichen morphologischen Änderungen im lrECM „on-top“ Assay, im Vergleich zur 2D Kultur auf Plastiksubstrat, gingen auch mit messbaren Änderungen der Expressionsprofile auf Transkriptions- und Proteinebene einher. Dies zeigte sich bei der Analyse ausgewählter Gene, welche bei der ECM Zell Interaktion, der Zell-Zell-Adhäsion und der Proliferation eine Rolle spielen. Um diese Änderungen auf Transkriptionsebene genomweit erfassen zu können, wurde eine Analyse des Transkriptoms aller sieben analysierten CRC Zelllinien mittels Agilent Array Analyse durchgeführt. Innerhalb jeder Zelllinie ließen sich in der hierarchischen Clusteranalyse die beiden Kulturbedingungen alleine anhand der Expressionsprofile trennen, was den erheblichen Einfluss der lrECM „on-top“ Kultur verdeutlicht. Insgesamt konnten 225 signifikant differentiell regulierte Gene identifiziert werden, wovon bei 14 Genen eine Interaktion untereinander bekannt war. Hierunter befanden sich interessanterweise auffällig viele Gene, die an der Zellproliferation und der Apoptose beteiligt sind. Diese Daten können gut die um 10-30 % reduzierte Proliferation der Zellen unter lrECM „on-top“ Kulturbedingungen im Vergleich zur 2D Kultur erklären. Weiterhin konnte bei der lrECM Kultur, sowohl eine verminderte EGFR-Expression, als auch eine differentielle Aktivierung innerhalb der EGFR-Signalkaskade nachgewiesen werden, was zu einem signifikant schlechteren Ansprechverhalten auf eine Anti-EGFR Behandlung führte. Dies ist beim CRC von besonderer Bedeutung, da hier EGFR eine wichtige therapeutische Zielstruktur ist. Insgesamt scheint die lrECM „on-top“ Kultur ein in vitro CRC Tumormodell zu sein, das die physiologische Umgebung und die Wachstumsbedingungen von Tumorzellen besser abbildet, auch wenn dieses Modell nicht alle Prozesse von der Tumorinitiation bis hin zur Metastasierung rekonstruieren kann. Es könnte jedoch ein geeignetes Modell für das Anwachsen von disseminierten Zellen zu Mikrometastasen darstellen. Die vorliegende Arbeit bietet nun einen ersten Einblick, welchen Einfluss die lrECM auf CRC Tumorzelllinien ausübt. Ein Ausbau dieses Modells als Hochdurchsatz-Verfahren könnte im Besonderen für präklinische Therapiestudien von wichtiger Bedeutung sein, um die Testung von neuen adjuvanten Therapiesubstanzen unter realistischeren Bedingungen durchführen zu können.The cultivation of permanent tumour cell lines represents the most important approach to conduct mechanistic studies on human tumour cells in vitro under controlled conditions. The cultivation of tumour cells as a two-dimensional (2D) monolayer on plastic substrates is still the most commonly used cultivation method although the cells are completely separated from their natural environment. Therefore, culture systems have been developed that allow a more realistic tumour modelling in vitro. In this context, the extracellular matrix (ECM) model appears to be particularly interesting because the ECM is an integral component of the natural environment of tumour cells in vivo interacting with the cells and providing them with essential signals for cell polarity, growth and cell survival. The aim of this study was to establish an ECM culture model for representative, permanent colorectal cancer (CRC) cell lines and to further systematically investigate the impact of the two different cell culture systems in cell biological and molecular terms. For the ECM culture (“on-top” assay), cells were embedded in laminin-rich extracellular matrix (lrECM). All cell lines formed tumour-like structures with a typical as well as reproducible morphology in the lrECM "on-top" model. The 3D morphologies were not correlated to the 2D phenotype of the CRC cells lines. Two different spheroid types were identified: a grape like morphology with loose cell-cell interactions and a compact growing, mass-like spheroid. Interestingly, all grape-like spheroids were generated from cell lines derived from metastases, while all cell lines derived from primary tumours formed compact growing spheroids. A correlation between the migratory or the invasive capacity and the two different morphology types was not observed. Grape-like spheroids showed a significantly reduced overall cell proliferation compared to the compact growing spheroid type in the lrECM “on top” assay. The observed, extensive morphological alterations in the lrECM “on-top” assay compared to 2D culture on plastic substrata were associated with measurable expression changes on the transcription- and protein-level. This was shown by the analysis of selected genes that play a crucial role in ECM-cell-interaction, cell-cell-adhesion und cell proliferation. In order to investigate the observed changes at the transcriptional level more globally, a transcriptome analysis of all seven investigated CRC cell lines was performed using Agilent Arrays. Hierarchal cluster analysis separated clearly the two culture conditions for every cell line according to their expression profiles demonstrating the considerable impact of the lrECM “on-top” culture on the cell lines. A set of 225 significantly differentially regulated genes was identified. Fourteen of these genes are known interaction partners and most of them are involved in cell proliferation and apoptosis. This observation might explain the reduction of cell proliferation by 10-30% that was noted under lrECM “on-top” conditions. Furthermore, upon lrECM culture condition a reduced EGFR expression as well as a differential activation within the EGFR-pathway was observed. This resulted in a statistically significant decreased response to anti-EGFR therapy, which is from a clinical point of view a relevant finding considering the importance of EGFR for CRC therapy. Taken together, the lrECM “on-top” cell culture model seems to represent a more physiological in vitro CRC tumour model. Of course, this model cannot represent all CRC progression steps from tumour initiation to metastasis. However, it should be a suitable model for the development of micrometastases, a most critical step for metastasis formation. In addition, the present work provides a first insight into the molecular changes associated with the interaction of CRC tumour cell lines with the lrECM. Since this lrECM model could be easily extended to a high-throughput scale, it could represent an effective in vitro strategy for preclinical therapeutic studies to test new adjuvant therapeutic substances under more realistic conditions. | |||||||
| Lizenz: |  Urheberrechtsschutz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät | |||||||
| Dokument erstellt am: | 25.08.2011 | |||||||
| Dateien geändert am: | 25.08.2011 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 05.05.2011 | |||||||
| Datum der Promotion: | 14.06.2011 |
