Dokument: The importance of the integrity of phytochromes for their biochemical and physiological function

Titel:	The importance of the integrity of phytochromes for their biochemical and physiological function
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=18776
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20110930-105425-4
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text Text
Autor:	Shah, Rashmi [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 3,06 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 27.07.2011 / geändert 27.07.2011
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Die Existenz von Phytochromen wurde zuerst in den fünfziger Jahren des vorigen Jahrhunderts in höheren Pflanzen nachgewiesen [1]. Diese rot/dunkelrot sensitiven Photorezeptoren wurden später dann für Cyanobakterien berichtet [2], und im Folgenden auch in nicht-photosynthetischen Bakterien und Pilzen [3]. Phytochrome konvertieren bei Belichtung zwischen Rotlicht-absorbierenden (664/704 nm, PR Zustände) und Dunkelrot-absorbierenden Formen (707/750 nm, PFR Zustände). Diese Photokonversion beruht auf einer Doppelbindung-Photoisomerisierung des Chromophors. In dieser Dissertation wurden vier verschiedene Aspekte dieser biologischen Photorezeptoren bearbeitet: (i) Die Phytochrome CphA und CphB aus dem Cyanobakterium Calothrix PCC7601 wurden dahin gehend untersucht, zu bestimmen, welche Proteindomänen essentiell sind, um die spektrale Integrität dieser Chromoproteine aufrecht zu erhalten. Beide Proteine bilden PAS-, GAF-, PHY-, und Histidine-kinase (HK) Domänen. CphA bindet Phycocyanobilin (PCB) als Chromophor und CphB bindet Biliverdin (BV) IXα. Es zeigte sich, dass die Entfernung der HK-Domäne keinen Effekt auf die Absorptionsmaxima der verbleibenden PAS-GAF-PHY Konstrukte hatte (CphA: 663/ 707 nm, CphB: 704/750 nm, für jeweils PR/PFR; diese Werte sind praktisch identisch zu denen der Volllängenproteine). Eine weitergehende Entfernung der „PHY“-Domänen führte zu einer Blauverschiebung beider Maxima für CphA (λmax: 658/698 nm) und zu einer größeren Menge an ungefaltetem Protein; dies ließ sich aus der geringeren Menge an assemblierbarem Protein ableiten. Im Fall von CphB führte die gleiche Deletion jedoch zum fast vollständigen Verlust der PFR-Absorption, während die spektralen Eigenschaften der PR-Form erhalten blieben. Wahrscheinlich bildet sich stattdessen ein Intermediat mit einer deutlich geringeren Oszillatorstärke. (ii) Im zweiten projekt wurde der Versuch unternommen, nicht-natürlich vorkommende hybride Proteine zu erzeugen. Hierzu wurde die Blaulicht-sensitive LOV-Domäne eines Photorezeptors aus Pseudomonas syringae (pv. tomato) mit der HK-Domäne eines Rotlicht-sensitiven Phytochroms (aus CphA) fusioniert. Ziel dieses Ansatzes war die Frage, ob sich die Kinaseaktivität auch mit einer veränderten Lichtdetektions-Domäne steuern lässt. Die im Rahmen dieses Projekts erhaltenen Ergebnisse zeigen zunächst den Erhalt der typischen Blaulicht-Photochemie. (iii) Im dritten projekt wurden Untersuchungen an dem Pflanzen-pathogenen Modellorganismus P. syringae (pv. tomato DC3000) durchgeführt. Genomsequenz-Analysen ergaben die Existenz zweier Gene für Rot-/Dunkelrot-sensitiven Phytochrome (PstBphP1 und PstBphP2) und eines weiteren Gens für einen Blaulicht-sensitiven Photorezeptor (PstLOV). Die Phytochrome wurden rekombinant in E. coli exprimiert und in vitro charakterisiert. Beide Proteine zeigen die typische modulare Struktur einer Dreidomänen Chromophor-Binderegion (PAS-GAF-PHY), an die sich C-terminal eine Histidinkinase anschließt. PstbphP1 liegt in einem Operon vor, in dem ein Hämoxygenase- (HO) kodierendes Gen vorangeht, während PstbphP2 von einem Gen gefolgt wird, das für einen response regulator kodiert. Heterologe Expression des HO-Gens ergab ein grünes Protein (λmax = 650 nm), dessen Farbe charakteristisch für gebundenes Biliverdin ist. Die heterologe Expression von PstbphP1 und PstbphP2 ergaben in beiden Fällen die Apoproteine, allerdings ließ sich nur im Fall von PstbphP1 das Holoprotein durch Zugabe von Biliverdin erzeugen. Beide Phytochrome wurden auch mit der Hämoxygenase ko-exprimiert, aber auch in diesem Falle konnte nur für PstbphP1 das Holoprotein nachgewiesen werden, während für sein Paralog PstbphP2 keine Chromophorabsorption nachgewiesen werden konnte. Eine noch mehr erhöhte Ausbeute an Protein mit verbesserten spektralen Eigenschaften wurde erhalten, wenn die vorhandene Operonstruktur ausgenutzt wurde, allerdings versagte dieser Ansatz wiederum für PstbphP2 (hier wurde Basen-genau das kodierende Gen für PstbphP2 an die Stelle von PstbphP1 gesetzt). Als Ursache für die deutlich verbesserte Ausbeute von PstbphP1 konnte eine Komplexbildung dieses Proteins mit der HO während der Expression nachgewiesen werden, die offensichtlich stabilisierend auf das Phytochrom wirkt. (iv) Die regulatorische Funktion der Rot-/Dunkelrot-sensitiven Phytochrome und auch des Blaulicht-sensitiven Rezeptors für das Bakterium wurden im vierten Teilprojekt durch knock-out insertierte Mutanten nachgewiesen. Da die üblicherweise angewandte Methode des Gentransfers mittels Konjugation/homologer Rekombination sehr zeitaufwändig und von geringer Effizienz ist, wurde in dieser Arbeit eine alternative Methode entwickelt, um nun mit Hilfe linearer doppelsträngiger DNA Interposon- und Punktmutationen dieser Photorezeptoren zu erzeugen. Vier Einzelmutanten, bphP1Δ, bphP2Δ, bphOΔ, pspto_2896 (LOVΔ) und eine Doppelmutante, bphP1ΔbphP2Δ, wurden auf diese Weise erzeugt. Die bphO- und pspto_2896 (LOV) Gene kodieren die bereits in (iii) diskutierten Hämoxygenase und den Blaulicht-sensitiven Photorezeptor. Der pspto_2896 Mutant-Stamm wurde auf seine Motilität in blauem Licht getestet (447 nm), während alle anderen Mutanten in rotem bzw. dunkelrotem Licht (625, 660, 720, 740 nm) auf Änderungen ihrer Motilität untersucht wurden. Es wurden für alle Mutanten Änderungen in ihrer Photokinese gefunden. Darüber hinaus wurde untersucht, ob die Mutantenstämme (bphP1Δ und der Blaulicht-Photorezeptor defiziente Stamm, LOVΔ) eine veränderte Infektivität gegenüber Pflanzen aufwiesen (Arabidopsis thaliana). Erste Ergebnisse zeigen, dass der Blaulicht- Photorezeptor im Wildtyp-Stamm im Vergleich zur Mutante unter Belichtung zu verringertem Wachstum führt, während kein entsprechender Effekt für den Phytochrom-Rezeptor nachweisbar war. Phytochrome pigments were first characterized in higher plants in the 1950’s [1]. These red/far red sensing biological photoreceptors were later reported also for cyanobacteria [2], and also in other non-photosynthetic bacteria and fungi [3]. Phytochromes interconvert between red light (664/704 nm, PR states) and far-red light (707/750 nm, PFR states) absorbing forms. This photoconversion represents a double bond photoisomerization of the covalently bound bilin chromophores In this work, four different research projects from the area of biological photoreceptors were followed: (i) The phytochromes CphA and CphB from the cyanobacterium Calothrix PCC7601 were investigated for the essential protein domains required to maintain the spectral integrity. Both proteins fold into PAS-, GAF-, PHY-, and Histidine-kinase (HK) domains. CphA binds phycocyanobilin (PCB) as chromophore and CphB binds biliverdin (BV) IXα. Removal of the HK domains had no effect on the absorbance maxima of the resulting PAS–GAF–PHY constructs (CphA: 663/ 707 nm, CphB: 704/750 nm, PR/PFR, respectively); these values are similar to the full length protein CphA and CphB. Further deletion of the “PHY” domains caused a blue-shift of the PR and PFR absorption of CphA (λmax: 658/698 nm) and increased the amount of unproperly folded apoprotein, seen as a reduced capability to bind the chromophore in a photoconvertible manner. In CphB, however, this deletion practically impaired the formation of PFR. The intermediate that can be generated shows an absorption band with very low oscillator strength, whereas the spectral features of the PR form remain unchanged. (ii) In an approach to generate non-naturally existing hybrid proteins, the blue-light sensor kinase module (PAS motif) of P. syringae pv tomato was fused with the red/far red photoreceptor HK from the cyanobacterial phytochrome CphA to study the kinase activity of such a reprogrammed (swapped) sensor kinase. This reprogrammed sensor LOV-kinase retained the typical photochemical properties of PstLOV. (iii) Recent genome sequence data of the model plant pathogen Pseudomonas syringae pv tomato DC3000 have revealed the presence of two red/far red sensing putative phytochrome photoreceptors (PstBphP1 and PstBphP2) and one blue-light photoreceptor (PstLOV). The bacterial phytochromes from P. syringae pv tomato (PstBphPs) were recombinantly expressed in E. coli and characterized in vitro. Both phytochromes show the general modular architecture of a three domain chromophore-binding region (PAS-GAF-PHY) that is followed by a histidine kinase domain at the C-terminal part. PstbphP1 is arranged in an operon with a preceding gene encoding a heme oxygenase (PstbphO), whereas PstbphP2 is followed by a response regulator. Heterologous expression of the heme oxygenase yielded a green protein (λmax = 650 nm), indicative for bound biliverdin. Heterologous expression of PstbphP1 and PstbphP2 yielded the apoproteins for both phytochromes, however, only in case of PstBphP1 a holoprotein was formed upon addition of biliverdin. The two phytochromes were also co-expressed with PstbphO as a two-plasmid approach yielding a fully assembled holoprotein for PstBphP1, whereas again for PstBphP2 no chromophore absorbance could be detected. An even further increased yield for PstBphP1 was obtained when the operon PstbphO: PstbphP1 was expressed in E. coli. A construct placing the gene for PstBphP2 exactly at the position of PstbphP1 in this operon again gave the negative result such that no phytochrome-2 chromoprotein was formed. The reason for the improved yield for the operon expression PstbphO: PstbphP1 is the formation of a complex formed between both proteins during biosynthesis. (iv) The regulatory functions of these red/ far red genes and of the also present blue light photoreceptor gene were studied by generating insertional knockout mutants. As the commonly applied protocol of gene transfer by conjugation/homologous recombination is a time-consuming process of low-efficiency, an alternative method was developed in this study to create interposon- as well as point mutations of the corresponding photoreceptors genes by employing linear DNA constructs. Four single mutant strains, bphP1Δ, bphP2Δ, bphOΔ, pspto_2896 (LOVΔ) and one double mutant strain, bphP1ΔbphP2Δ were generated using the new method. The bphO- and the pspto_2896 (LOV) genes encode the heme oxygenase and the blue light-sensitive photoreceptor, described in sub-project (iii). The pspto_2896 mutant strain was tested for the motility in blue light (447 nm), and all the other mutants were tested under red/ far red (625, 660, 720, 740 nm) light for changes in their motility. All mutant strains showed photokinesis response to the blue/red/ far red light. Further, the effect of mutations on infectivity on plants was studied for the phytochrome mutant strain (bphP1Δ), and the blue-light photoreceptor (LOVΔ) mutant strain. Our preliminary experiments of plant-mutant interaction indicate that light perceived by the LOV-domain photoreceptor reduces bacterial growth (this behavior is not observed for the mutant strain), whereas no such effect is observed for the phytochrome photoreceptor.
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Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät
Dokument erstellt am:	30.09.2011
Dateien geändert am:	30.09.2011